分光光度法測定膽紅素(改良J—G 法)
一、實驗?zāi)康?/span>
1.掌握測定血清膽紅素的原理與方法。
2.深入了解膽紅素的生理作用。
二、實驗原理
血清與醋酸鈉—咖啡因—苯甲酸鈉試劑(咖啡因試劑)混合后，加入氯化重氟苯磺酸(重氮試劑)，生成紫紅色偶氮膽紅素，最后加入強堿性酒石酸鈉溶液，使顏色不穩(wěn)定的紫紅色偶氮膽紅素在咖啡因存在下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的藍(lán)色偶氮膽紅素。醋酸鈉緩沖液保持偶氮反應(yīng)的pH；咖啡因試劑中苯甲酸鈉—咖啡因促進(jìn)未結(jié)合膽紅素溶解，破壞游離膽紅素分子 內(nèi)的氫鍵，加速與重氮試劑的偶聯(lián)反應(yīng)；疊氮鈉(或抗壞血酸)可終止結(jié)合膽紅素的偶氮反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在600nm 波長比色，從標(biāo)推曲線查找總膽紅素和結(jié)合膽紅素含量。
三、儀器和試劑
儀器
可見光分光光度計
試劑
1. 咖啡因試劑 無水醋酸鈉82g，苯甲酸鈉75g，EDTA Na2l.0g，溶于約500mL 的蒸餾水中，再加入咖啡因50g，攪拌至完全溶解，然后加蒸餾水稀釋至1000mL，過濾后放置棕色試劑瓶中，室溫保存可穩(wěn)定6個月。
2. 5g/L 亞硝酸鈉溶液：亞硝酸鈉5.0g，加蒸餾水溶解并稀釋至100mL，若發(fā)現(xiàn)溶液呈淡黃色時，應(yīng)丟棄重配。
3. 5g/L 對氨基苯磺酸溶液：對氨基苯磺酸5.0g，加于約800mL 蒸餾水中，加濃鹽酸15mL，待完全溶解后，加蒸餾水至1000mL。
4. 重氮試劑臨用前，取試劑20.5mL 與5g/L 對氨基苯磺酸溶液20mL 混合。
5. 5g/L 疊氮鈉溶液：疊氮鈉0.5g，用蒸餾水溶解并稀釋至100mL。
6. 堿性酒石酸鈉溶液：氫氧化鈉75g，酒石酸鈉(含2分子水)263g，加蒸餾水溶解并稀釋至1000mL，混勻，置塑料瓶中，室溫保存可穩(wěn)定6個月。
7. 342μmol/L 膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液：收集不溶血、無黃疽、清晰的血清作為混合血清稀釋劑。混合血清稀釋劑應(yīng)符合下列要求：混合血1.0mL，加生理鹽水24mL，混勻。在分光光度計中，以比色杯光徑1cm，波長414nm，用生理鹽水調(diào)零，讀取的吸光度應(yīng)小于0.100，波長460nm 處讀取的吸光度應(yīng)小于0.040。
四、操作步驟
(一)膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
稱取符合標(biāo)難的純膽紅素(MW584．68)20.0mg，加二甲亞砜4mL 溶解。在50mL 容量瓶中，加入混合血清稀釋劑約40mL，緩慢加入上述膽紅素二甲亞砜溶液2mL，邊加邊混勻，盡量避免產(chǎn)生泡沫，然后補加混合血清，稀釋至刻度，混勻。該標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)避光置冰箱，可保存數(shù)天。但最好用于當(dāng)天繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
按表下表配制五種不同濃度的膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液，表中各管充分混勻．然后按照血清總膽紅素方法進(jìn)行測定。每一濃度平行做3管，以各濃度管吸光度值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的膽紅素濃度為橫坐標(biāo)，作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(二)膽紅素的測定
按表下表的順序與加量進(jìn)行操作。結(jié)合膽紅素管在加入重氮試劑混勻后準(zhǔn)確1min，加入5g/L 疊氮鈉溶液0.05mL 和咖啡因試劑1.6m1，混勻，總膽紅素管室溫放置10min，然后向各管加入堿性酒石酸鈉1.2m1，混勻，用分光光度計660nm 波長，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出總膽紅素和結(jié)合膽紅素濃度。
北京天優(yōu)福康生物科技有限公司
官網(wǎng)：http://www.dhfpump.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
