高效液相色譜法測定植物的內源激素含量

簡介

植物內源激素對植物的生長發育起著極其重要的調控作用，極微量就表現出明顯的生理作用。但由于植物體內源激素濃度很低，而且植物體成分復雜，干擾組分多，分離時易被破壞，給激素的分析測定工作帶來許多困難。

酶聯免疫法檢測植物內源激素靈敏度高但重復性較低，高效液相色譜法適用于多類不同性質化合物的測定和分離，具有靈敏度高，選擇性、重復性好及分析速度快等特點，是較為理想的植物內源激素分析方法。本實驗介紹生長素（IAA）、赤霉素（GA）、玉米素（ZR）和脫落酸（ABA）四種激素的提取和測定方法。

原理

高效液相色譜法在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，具有高壓、高 速、高效、高靈敏度等優點。色譜儀中的分離系統包括固定相和流動相，溶于流動相的各組分經過固定相時，由于與固定相發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱程度不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，進入檢測器進行檢測。

材料與儀器

材料：

小麥或水稻等植物葉片

試劑：

100% 甲醇（色譜純）、80% 甲醇（分析純）、石油酷、乙酸乙酯、生長素、赤霉素、玉米素、脫落酸標準品

器材：

Agilent 1200 液相色譜儀、研缽、布氏漏斗、旋轉蒸發干燥器、分液漏斗、濾紙、微 量注射器、0.45 μm 微孔濾膜

步驟

高效液相色譜法測定植物的內源激素含量的基本過程可分為如下幾步：

1. 試驗材料的處理：

稱取 1~2 g 樣品，在冰浴下研磨成漿，加入 80% 的預冷甲醇 20 mL，保鮮膜密封，在 4 °C 冰箱里冷浸過夜。浸提液抽濾，10 mL 甲醇潤洗研缽 2 次，過濾后與浸提液合并，40 °C 下減壓蒸發至沒有甲醇殘余。剩余水相完全轉移到三角瓶中。

用 30 mL 石油醚萃取脫色 2 次，棄去醚相。加 0. 01 g PVPP（交聯聚乙烯毗咯烷酮），超聲 30 min，抽濾用 30 mL，乙酸乙酯萃取 3 次，合并酯相，40 °C 下減壓蒸干。用甲醇（色譜純）溶解殘渣并定容至 2 mL，經 0.45 微孔濾膜過濾得待測液，保存于 4 °C 冰箱中。

2. 將色譜儀啟動，步驟如下：

（1）打開電腦和色譜各個模塊的電源。

（2）雙擊桌面「儀器一聯機」，進入聯機界面。

（3）手動旋開泵處沖洗閥，右鍵單擊「泵」圖標，調節流速為 5 mL · min-1，打開所有泵，系統開始沖洗，直到管線內（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止（一般為 5~10 min），切換通道繼續遊物生理學宴驗指導沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止，設流速為 0 mL · min -1，手動旋緊沖洗閥。

（4）點擊「方法」一「新建方法」，創建新的方法。右鍵單擊「泵」圖標，按照方法要求選擇合 適比例的流動相，設流速：1.0 mL · min -1 右鍵單擊「檢測器」圖標，波長設置為 254 nm，打開檢測器，待基線穩定后約 10 min 即可正式測定。

3. 測定

（1）標準曲線的繪制：取一定量生長素、赤霉素、玉米素和脫落酸標準品，用甲醇（色譜純） 溶解，配制成不同濃度的溶液，點擊「運行控制」菜單，選擇「運行方法」，手動或自動進樣器進樣 10~30 ptL，進行液相檢測分析。在一定濃度范圍內，四種激素峰面積與濃度呈良好的線性關系時，即可繪制標準曲線。

（2）測定：取同樣量的待測樣品，進樣。待樣品峰全部出完后，沖洗 30 min 即可做下一個樣品。

（3）定性：樣品中與標準品保留時間相同的峰，即為樣品的激素峰。

4. 得到所有樣品色譜圖后，可關機。關機步驟如下：

（1）關機前，用甲醇充分沖洗系統大約 30 min（色譜柱最終應保存在甲醇或乙睛中）。

（2）退出化學工作站，關閉各泵及其他窗口，關閉計算機。

（3）關閉液相色譜儀各模塊電源開關。

5. 通過樣品的峰面積以及標準曲線，計算出樣品中各激素的含量。

注意事項

1. 柱壓上限：建立的液相方法其柱壓上限應小于 3800 psi。

2. 流動相的使用：任何流動相必須用 0.45 μm 濾膜抽濾兩遍，其 pH 及流動相的選擇必須在色譜柱允許范圍內。

3. 樣品的處理：樣品進樣前必須過 0.45 μm 的濾膜，其 pH、分子量大小、在流動相中的溶解性及純度必須符合要求。