植物組織種丙二醛含量的測定

簡介

了解丙二醛(malondialdehyde, MDA )在生物體形成的因素；重點掌握MDA測定的原理和測定方法；進一步熟悉和掌握分光光度計和離心機的使用方法和注意事項。

原理

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化分解的最終產物之一，其含量可以反映膜脂過氧化的程度。同時，MDA在生物體內積累還會對細胞膜造成進一步的傷害，所以MDA的含量可以反映生物體衰老和遭受逆境傷害的程度。

植物組織中的MDA在酸性條件下加熱可與硫代巴比妥酸(TBA)產生顯色反應，反應產物為粉紅色的3，5，5-三甲基噁哩2，4-二酮。該物質在532 nm波長下有吸收峰。由于硫代巴比妥酸也可與其他物質反應，并在該波長處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其他物質反應的影響。在丙二醛含量測定時，同時測定600 nm下 的吸光度，利用532 nm與600 nm下的吸光度的差值計算丙二醛的含量。

材料與儀器

材料：4種菠菜樣品，即室溫對照處理的綠色葉片和黃色葉片，高溫處理的綠色葉片和黃色葉片。

試劑：0.05 mol · L-1 pH 7.8磷酸鈉緩沖液；石英砂；

5% 三氯乙酸溶液：稱取5 g三氯乙酸，先用少量蒸個水溶解，然后定容到100 mL；

0.5% 硫代巴比妥酸溶液：稱取0.5 g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶解，定容至100 mL。

器材：分光光度計，離心機,水浴鍋，天平，研缽，剪刀，5 mL刻度離心管

10 mL刻度試 管，鐐子，5 mL、2 mL、1 mL移液管，冰箱。

步驟

植物組織種丙二醛含量的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 丙二醛的提取：取5 g樣品，加入2 mL預冷的0. 05 mol · L-1 pH 7.8的磷酸緩沖液，加入少量石英砂，在經過冰浴的研缽內研磨成勻漿，轉移到5 mL刻度離心試管中，將研缽用緩沖液洗凈.清洗液移入離心管中，最后用緩沖液定容至5 mL。在4 500 r · m-1條件下離心10 min。上清液即為丙二醛提取液。

2. 丙二醛含量測定：吸取2 mL的提取液于刻度試管中，加入5% 硫代巴比妥酸溶液 3 mL,于沸水浴上加熱10 min,迅速冷卻。于4500 r · min-1離心10 min 取上清液于532、 600 nm波長下，以蒸憎水為空白調透光率100%，測定吸光度。

3 .結果計算：

式中以一吸光度；

V1 —反應液總體積，4 mL；

V一提取液總體積，5 mL；

V2一反應液中的提取液體積，2 mL；

W一植物樣品重量，0.5 g；

1.55X10-1—丙二醛的微摩爾吸光系數（在1 L溶液中含有1 μmol 丙二醛時的吸光度）。

注意事項

1. 1%~0. 5% 的三氯乙酸對MDA-TBA反應較合適，若高于此濃度，其反應液的非專一性吸收偏高。

2. MDA-TBA顯色反應的加熱時間，最好控制在沸水浴10~15 min。時間太短或太長均會引起532 nm下的光吸收值下降。

3. 如用MDA作為植物衰老指標，首先應檢驗被測試材料提取液是否能與TBA反應形成532 nm處的吸收峰。否則只測定600 nm兩處A值，計算結果與實際情況不符，測得的高A值是一個假象。

4. 在有糖類物質干擾條件下（如深度衰老時），吸光度的增大，不再是由于脂質過氧化產 物MDA含量的升高，而是水溶性碳水化合物的增加，由此改變了提取液成分，不能再用 532 nm、600 nm兩處A值計算MDA含量，可測定510、532、560 nm處的A值，用A532 -（A510-A560 ）/2的值來代表丙二醛與TBA反應液的吸光值。