酶聯免疫吸附法測定植物激素含量

簡介

植物的生長發育、基因表達以及對環境刺激的反應均受體內激素平衡的制約。但是，由于內源激素含量極低，在實驗室中要精確快速測定是比較困難的。植物激素(planl hormone)的免疫法測定極大地促進了植物激素的研究。

本實驗的目的是掌握酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定植物激素含量的原理及操作，熟悉酶聯免疫檢測儀的使用。

原理

1. 在ELISA中，抗原抗體反應的檢測依靠酶標記物來實現，常用的酶有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標記激素分子，稱為酶標植物激素，也可標記于第二抗體 (識別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白)，稱為酶標二抗。這兩類標記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。

（1) 固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體(MAb)與已吸附于固相載體上的兔抗鼠1 g抗體(RAMIG)結合，然后加入激素標準品或待測樣品,使其與固相化的MAb結合，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記激素(酶標激素)。通過測定酶標激素的被結合量，可換算出未知樣品中激素的數量。

(2) 固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復合物(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白)包被于固相載體，加入待測激素(樣品或標準品)和抗IAA多克隆抗體(PAb)反應，進行競爭反應，然后讓HRP標記羊抗兔Ig抗體(HRP-GARIG)與結合在固相上的PAb反應，通過測定與固相結合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

材料與儀器

材料：

高等植物、真菌、藻類等組織或器官。

試劑：

（1）洗滌緩沖液：0.01 mol · L-1 pH 7.4 磷酸緩沖液(PBS)，內含 0. 055% Tween-20；

（2）RAMIG溶液或“激素-蛋白”復合物；

（3）1% 封閉蛋白(該蛋白應不同于免疫原中的載體蛋白)；

（4）抗激素MAb或PAb；

（5）激素標準品母液及參比系列溶液(按雙倍或4倍系列稀釋)；

（6）HRP 標記激素或 HRP-GARIG；

（7）鄰苯二胺(OPD)基質液：稱取 5 mg OPD溶于 5 mL 0.01 mol · L-1 pH 5.0 的磷酸緩沖液中，用前加入30% BAX 12.5 μL。

器材：酶聯免疫檢測儀、高速冷凍離心機、恒溫箱、連續進樣器、渦旋儀

96孔微孔板、離 心管、研缽或勻漿器、試管等。

步驟

酶聯免疫吸附法測定植物激素含量的基本過程可分為如下幾步：

（一） 固相抗體型ELISA

1. 用方陣法滴定選擇各反應物最適工作濃度。

2. 將100 μL RAMIG溶液包被聚苯乙烯反應板微孔4 °C濕盒，12 h。

3. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

4. 加入100 μl 抗激素 MAb 溶液,37 °C，70 min。

5. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

6. 各孔內依次加入50 μL待測樣液，每個樣品3次重復，15~20 °C，20 min。

7. 加入50 μL HRP標記激素，37 °C ，60 min。

8. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次,甩干。

9. 加入 100 μL OPD 基質液，37 °C顯色 15~20 min,加入 50 μL 3mol · L -1 H2SO4，溶液 終止反應。用酶聯免疫檢測儀測定490 nm下各孔的A490值，求出每份樣品重復孔的平均值。

10. 用激素標準品母液和參比系列溶液.在同一微孔板上同上法操作。

（二） 固相抗原型ELISA

1. 用方陣法滴定選擇各反應物最適工作濃度。

2. 將100 "激素-蛋白" 復合物溶液包被于微孔板，37 °C,12 h。

3. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

4. 加入100 μL 1% 封閉蛋白溶液封閉,37 °C,30 min。

5. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

6. 各孔同時加入50 μL樣液和50 μL抗激素PAb溶液，以加入正常兔血清溶液的孔（非特異吸附孔）為空白調零，37 °C,60 min。

7. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

8. 加入 100 μL HRP-GARIG 溶液,37 °C，60 min。

9. 棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干。

10. 隨后的顯色、中止與比色程序同上。

11. 用激素標準品母液和參比系列溶液，在同一微孔板上同上法操作。

（三） 結果計算

1. 因相抗體型ELISA。

（1) 以加入激素母液的孔（非特異吸附孔）為空白調零，以加入不含激素的PBS的孔為B0

孔，以加入激素標準參比系列溶液的各孔為 Bi 孔。以標準激素物質的量的常用對數lg n為橫坐標（x），對應的 ln [Bj/（Bo - Bj）] 為縱坐標（y），可得一條直線y =a +bx。

（2) 將樣品孔的人傾值代入上式，換算出待測樣品中激素的物質的量，乘以稀釋倍數，除 以樣品重量，即為每克樣品的激素含量。

2. 固相抗原型ELISA。

以加入不含激素的磷酸緩沖液的孔為Bo孔，以加入激素標準參比系列溶液的各孔為Bj孔，標準曲線計算與結果分析同上。

注意事項

1. 注意: 酶聯免疫檢測儀的原理及使用方法。

2. 必須了解所采用抗體的特異性，未經過嚴格交叉反應試驗的抗體不能用于免疫檢測，否則會導致錯誤的結果。