超氧化物歧化酶（SOD）活力測定

簡介

學習和掌握氯化硝基四氮哩藍（NBT）光化還原法測定SOD活力的方法和原理。并了解SOD的作用特性。

原理

1. 植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內(nèi)自由基代謝平衡被破壞而有利于自由基的產(chǎn)生。自由基是具有未配對價電子的原子或原子團。生物體內(nèi)產(chǎn)生的自由基主要有超氧自由基（O2-?）、羥自由基（OH?）、過氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物細胞膜有 酶促和非酶促兩類過氧化物防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物 酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系統(tǒng)的重要保護酶。抗壞血酸 （維生素C）、維生素E和還原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系統(tǒng)中的重要抗氧化劑。 CAT等活性氧清除劑的含量水平以及O2-?、H2O2、OH · 和O2等活性氧的含量水平可作為植物衰老的生理生化指標。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類 型的SoD：Mn-SOD和Cu. Zn-SOD,它們能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧自由基 （O2-?），生成 H2O2 和 O2。H2O2由過氧化氫酶（CAT）催化生成H2O和O2。從而減少自由基對有機體的毒害。反應式如下：

由于超氧自由基（O廣）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測定SOD活性一般為間接方法，并利用各種呈色反應來測定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負離子O2-?，當加入NBT后，在光照條件下，與超氧自由基反應生成單甲膳（黃色），繼而還原生成二甲臘，它是一種藍色物質(zhì)，在560 nm波長下有最大吸收峰。

當加入SOD時，可以使超氧自由基與H+結(jié)合生成H2O2和O2，從而抑制了NBT光還原的進行，使藍色二甲臘生成速度減慢。通過在反應液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時間后測定560 nm波長下各液光密度值，抑制NBT光還原相對百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比，以酶液加入量為橫坐標， 以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，在坐標紙上繪制出二者的相關曲線，根據(jù)SOD抑 制NBT光還原相對百分率計算酶活性。找出SOD抑制NBT光還原相對百分率為50% 時的酶量作為一個酶活力單位（U）。

材料與儀器

1. 材料:小麥、玉米、水稻、棉花等新鮮葉片。

2. 試劑。

（1） 0.1 mol ? L-1pH 7.8 磷酸鈉（N2HPO4-NaH2PO4）緩沖液：

A液（0.1 mol - L-1 Na2HPO4溶液）：準確稱取Na2HPO4?12H2O （相對密度為 358.14）3.5814 g于100 mL小燒杯中，用蒸餾水溶解后，移入100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

B液（0.1 mol?L-1 NaH2PO4溶液）：準確稱取NaH2PO4?2H2O （相對密度為156.01） 0. 780 g于50 mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，移入50 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻 度，充分混勻。4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

取上述A液183 mL與B液17 mL充分混勻后即為0.1 mol · L-1 pH 7. 8的磷酸鈉緩沖液。4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

（2） 0.026 mol · L-1蛋氨酸（Met）磷酸鈉緩沖液：準確稱取L-蛋氨酸（C5H11NO2S,相對密度為149.21）0.3879 g于100 mL小燒杯中，用少量0.1 mol · L-1 pH 7. 8的磷酸鈉緩沖 液溶解后，移入100 mL容量瓶中并用0.1 mol · L-1 pH 7. 8的磷酸鈉緩沖液定容至刻度，充 分混勻（現(xiàn)用現(xiàn)配）。4 °C冰箱中保存可用1~2d。

（3）7.5×10-4 mol?L-1NBT溶液：準確稱取NBT（C4OH3OCl2N10O6，相對密度為 817. 7）0. 153 3 g于100 mL小燒杯中，用少量蒸餾溶解后，移入250 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻（現(xiàn)配現(xiàn)用）。4°C冰箱中保存可用2~3 d。

（4）含 1.0 μmol ? L-1EDTA 的 2×10-5 mol . L-1 核黃素溶液：

A液：準確稱取EDTAC相對密度為292）0. 00292 g于50 mL小燒杯中，用少量蒸餾水溶解。

B液：準確稱取核黃素（相對密度為376.36）0.0753 g于50 mL小燒杯中，用少量蒸餾水 溶解。

C液：合并A液和B液，移入100 mL容量瓶中，用蒸個水定容至刻度，此溶液為含 0.1 mmol · L-1EDTA的2 mmol · L -1核黃素溶液。該溶液應避光保存，即用黑紙將裝有該液的棕色瓶包好，置于4°C冰箱中保存可用8-10 d。

當測定SOD酶活時，將C液稀釋100倍，即為含1.0 μnmol · L-1 EDTA的2X10-5mol · L-1 核黃素溶液。

（5）0.05 mol · L-1 pH 7.8磷酸鈉緩沖液：取0.1 mol · L-1 pH 7.8的磷酸鈉緩沖液 50 mL,移入100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，充分混勻。4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

（6）石英砂。

3.器材：分光光度計，分析天平，高速冷凍離心機，冰箱，4500 lx光照箱，帶蓋瓷盤，移液 管架，研缽，5 mL離心管，10~15 mL微燒杯，0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL移液管或加樣器， 50 μL、100 μL 微量進樣器，50 mL、100 mL、500 mL、1 000 mL 燒杯，50 mL、100 mL 量筒， 50 mL、100 mL、250 mL、1000 mL 容量瓶，125 mL 細口瓶。

步驟

超氧化物歧化酶（SOD）活力測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 酶液的制備：按每克鮮葉加入3 mL 0.05 mol · L-1pH 7. 8磷酸鈉緩沖液，加入少量石 英砂，于冰浴中的研缽內(nèi)研磨成勻漿，定容到5 mL刻度離心管中，于8 500 r · min-1： （10 000 g）冷凍離心30 min，上清液即為SOD酶粗提液。

2. 酶活力的測定：每個處理取8個洗凈干燥好的微燒杯編號，按表38-1加入各試劑及酶液，反應系統(tǒng)總體積為3 mL。其中4~8號杯中磷酸鈉緩沖液量和酶液量可根據(jù)試驗材料中酶液濃度及酶活力進行調(diào)整（如酶液濃度大、活性強時，酶用量適當減少）。

各試劑全部加入后，充分混勻，取1號微燒杯置于暗處，作為空白對照，比色時調(diào)零用。 其余7個微燒杯均放在溫度為25 °C ,光強為4 500 lx的光照箱內(nèi)（安裝有3根20 W的日光燈 管）照光15 min,然后立即遮光終止反應。在560 nm波長下以1號杯液調(diào)零，測定各杯液光 密度并記錄結(jié)果。以2、3號杯液光密度的平均值作為抑制NBT光還原率100%，根據(jù)其他各 杯液的光密度分別計算出不同酶液量的各反應系統(tǒng)中抑制NBT光還原的相對百分率。以酶 液用量為橫坐標，以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，作出二者相關曲線。找出50% 抑制率的酶液量（ptL）作為一個酶活力單位（U）。

1. 結(jié)果計算：

（1）測560 nm波長下各杯液的光密度填于表38-2中。

以酶液加入量為橫坐標，以抑制NBT光還原相對百分率為縱坐標，在坐標紙上繪制出二 者相關曲線。找出50% 抑制率的酶液量（卩L）作為一個酶活力單位（U）。

（2）SOD酶活力按下式計算：

V一酶提取液總體積，mL；

B——個酶活力單位的酶液量，μL；

W一樣品鮮重，g;

T一反應時間，min；

1 000—1 mL=1000 μL

60一1 h=60 min。

抑制率按下式計算：

式中：9—2、3號杯液的光密度平均值；

D?一加入不同酶液量的各杯液的光密度值。

注：有時因測定樣品的數(shù)量多，每個樣品均按此法測定酶活力工作量將會很大，也可每個 樣品只測定1個或2個酶液用量的光密度值，按下式計算酶活力。

式中：D1一2、3號杯液的光密度平均值；

D2 -測定樣品酶液的光密度；

50% —抑制率為50% ；

其他各因子代表的內(nèi)容與上述SOD酶活力計算公式的各因子代表的內(nèi)容相同。

注意事項

1. 富含酚類物質(zhì)的植物(如茶葉)在勻漿時產(chǎn)生大量的多酚類物質(zhì)，會引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此類植物SOD酶時，必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑，將多酚 類物質(zhì)除去，避免酶蛋白變性失活，一般在提取液中加1% ~4% 的聚乙烯毗咯烷酮(PVP)。

2. 測定時的溫度和光化反應時間必須嚴格控制一致。為保證各微燒杯所受光強一致，所有微燒杯應排列在與日光燈管平行的直線上。