過氧化氫酶（POD）活性的測定

簡介

掌握比色法測定過氧化物酶活性的原理及方法。

原理

過氧化物酶(POD)催化過氧化氫氧化酚類的反應(yīng)，產(chǎn)物為醍類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其他分子縮合，產(chǎn)生顏色較深的化合物。本實驗以鄰甲氧基苯酚(即愈創(chuàng)木酚)為過氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，該物質(zhì)可用分光光度計在470 nm處測定其吸光值，即可求出該酶的活性。其反應(yīng)為：

材料與儀器

材料:水稻根系、馬鈴薯塊莖等。

試劑：

（1）0.1 mol · L-1 Tris-HCl 緩沖液(pH 8.5)：取 12.114 g 三羥甲基氨基甲烷(Tris),加 水稀釋，用 HCl 調(diào)pH 8.5后定容1000 mL。

（2）2 mol · L-1 磷酸緩沖液(pH 6. 0):

貯備液 A：0.2 mol · L-1 NaH2PO4 溶液(27.8 g NaH2PO4 · H2O 配成 1000 mL)。

貯備液 B：0.2 mol · L-1 Na2 HPO4 溶液(53. 65 g Na2 HPO4 · 7H2O 或 71.7 g Na2HPO4 · 12H2 O 配成 1000 mL ) o

分別取貯備液A 87.7 mL與貯備液B 12.3 mL充分混勻并稀釋至200 mL。

反應(yīng)混合液：取 2 mol?L-1磷酸緩沖液(pH 6.0) 50 mL、過氧化氫0.028 mL、愈創(chuàng)木酚0.019 mL混合。

3.器材：分光光度計，移液管，離心機(jī)，秒表，研缽，天平等。

步驟

過氧化氫酶（CAT）活性的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 酶液提取：取不同水稻根系（根系表面水分吸干）1 g，剪碎置于研缽中，加5 mL 0.1 mol · L-1 Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）,研磨成勻漿，以4000 r?min-1離心5 min,傾出上清液，必要時殘渣再用5 mL緩沖液提取一次，合并兩次上清液，保存在冰箱（或冷處）備用。

2. 取光徑1 cm比色杯2個在其中1個中加入反應(yīng)混合液3 mL和磷酸緩沖液1 mL（或加熱煮沸5 min的酶液），作為校零對照，另1個中加入反應(yīng)混合液3 mL,上述酶液1 mL（如酶活性過高可稀釋之），立即開啟秒表記錄時間，用分光光度計在波長470 nmT測量吸光度值， 每隔1 min（60 s）讀數(shù)1次共測3 min。

3. 結(jié)果計算：以每分鐘光密度變化（以每分鐘人以A470為 0.01個活力單位）表示酶活性大小，即

式中：A470—反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；

Vt一粗酶提取液總體積，mL；

V1一測定用粗酶液體積，mL；

FW—樣品鮮重，g;

0.01—A470 每下降0.01為1個酶活單位，U；

t一反應(yīng)時間，min。

注意事項

1. 酶的提取、純化需在低溫下進(jìn)行。

2. H2O2要在反應(yīng)開始前加，不能直接加入。

3 .酶促反應(yīng)較快，計時應(yīng)準(zhǔn)確、快速。