混合液浸提法

原理

根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長下測定其光密度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。

根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的光密度D與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即：

D=kCL

式中：k為比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，k為該物質的比吸收系數。各種有色物質溶液在不同波長下的比吸收系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的光密度而求得。

如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總光密度等于各組分在相應波長下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的光密度D，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區的最大吸收峰。

已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據加和性原則列出以下關系式：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb                                             （1）

D645 = 16.75Ca+45.60Cb                                            （2）

式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645                                          （3）

Cb = 22.88D645 – 4.67D663                                          （4）

將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：

CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663                                  （5）

另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數（均為34.5），也可以在此波長下測定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量：

CT =（D652 × 1000）/ 34.5                                          （6）

在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素的含量。

Lichtenthaler等對Arnon法進行了修正，提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計算公式：

Ca = 12.21D663 – 2.81D646                                           （7）

Cb = 20.13D646 – 5.03D663                                          （8）

Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229                             （9）

式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx·c為類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm和470nm下的光密度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據此列出以下關系式：

Ca = 13.95D665 – 6.88D649                                         （10）

Cb = 24.96D649 – 7.32D665                                         （11）

Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245                           （12）

材料與儀器

植物葉片
96%乙醇 石英砂 碳酸鈣粉
分光光度計 研缽 剪刀 棕色容量瓶 小漏斗 滴管 電子頂載天平

步驟

1. 取新鮮植物葉片（或其他綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。

2. 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2——3ml 96%乙醇（或80%丙酮）研成勻漿，再加乙醇10ml，繼續研磨至組織變白，靜置3——5min。

3. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。

5. 把葉綠體色素提取液倒入比色杯內。以96%乙醇為空白，在波長665nm、649nm和470nm下測定光密度。

6. 按公式（10）、（11）、（12）（如用80%丙酮，則按公式7、8、9）分別計算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的濃度（mg/L），（10）、（11）式相加即得葉綠素總濃度。

7. 求得色素的濃度后計算組織中各色素的含量。

注意事項

1. 為了避免葉綠素的光分解，操作時應在弱光下進行，研磨時間應盡量短些。

2. 葉綠體色素提取液不能渾濁。可在710nm或750nm波長下測量光密度，其值應小于當波長為葉綠素a吸收峰時光密度值的5%，否則應重新過濾。

3. 用分光光度計法測定葉綠素含量，對分光光度計的波長精確度要求較高。如果波長與原吸收峰波長相差1nm，則葉綠素a的測定誤差為2%，葉綠素b為19%，使用前必須對分光光度計的波長進行校正。校正方法除按儀器說明書外，還應以純的葉綠素a和b來校正。

4. 在使用低檔型號分光光度計（如：72型、125型、721型等）測定葉綠素a、b含量時，因儀器的狹縫較寬，分光性能差，單色光的純度低（±5——7nm），與高中檔儀器如島津UV-120、UV-240等測定結果相比，葉綠素a的測定值偏低，葉綠素b值偏高，a/b比值嚴重偏小。因此，使用時必須用高檔分光光度計對低檔的分光光度計進行校正。

常見問題

研磨時應在弱光下進行，研磨時間要盡量短。提取液不能混濁，否則應重新過濾。