葉綠體色素的定量測(cè)定

簡(jiǎn)介

植物葉綠體色素含量直接影響植物的光合作用和作物產(chǎn)量，還與植物水分與礦質(zhì)營養(yǎng)的供應(yīng)、逆境條件和植物衰老密切相關(guān)。葉綠體含量也是反映葉片的生長(zhǎng)、發(fā)育情況的重要生理指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)并掌握葉綠體色素的定量測(cè)定方法。

原理

葉綠體色素的定量測(cè)定的基本原理是根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其消光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。

根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度c和液層厚度L成正比，即：

A = kcL    （14-1）

式中：A一消光度；

c一溶質(zhì)濃度；

L—液層厚度；

k一比例常數(shù)。

當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為 1 cm 時(shí)，為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)，可測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的消光度而 求得。

如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總消光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下消光度的總和，這就是消光度的加和性。測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素 a、葉綠素 b 和類胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在 3 個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度 A ，并根據(jù)葉綠素 a、葉綠素 b 及類胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素 a、葉綠素 b 時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。

已知葉綠素 a、葉綠素 b 的 80% 丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為 663 nm 和 645 nm，又知在波長(zhǎng) 663 nm 下，葉綠素 a、葉綠素 b 在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為 82.04 和 9.27，在波長(zhǎng) 645 nm 下分別為 16.75 和 45.60，可根據(jù)加和性原則列岀以下關(guān)系式：

A663 = 82.04 ca + 9.27 cb    （14-2）

A645 = 16.75 ca + 45.60 cb    （14-3）

式中：A663、A645—葉綠素溶液在波長(zhǎng) 663 nm 和 645 nm 時(shí)的消光度；

ca、cb一葉綠素 a 和葉綠素 b 的濃度，mg?L-1。

解方程組（14-2）、（14-3）得：

ca = 12.72 A663 - 2.59 A645    （14-4）

cb = 22.88 A645 - 4.67 A663    （14-5）

將ca 與 cb 相加即得葉綠素總量cT

cT = ca + cb = 20.29 A645 + 8.05 A663    （14-6）

另外，由于葉綠素 a、葉綠素 b 在 652 nm 的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為 34.5），也可以在此波長(zhǎng)下測(cè)定一次消光度（A652）而求出葉綠素 a、葉綠素 b 總量：

cT =（A652 × 1 000）/34.5    （14-7）

在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí)測(cè)定出溶液中類胡蘿卜素的含量。Li-chten-thaler 等對(duì) Arnon 法進(jìn)行了修正，提出了 80% 丙酮提取液中 3 種色素含量的計(jì)算公式：

ca = 12.21 A663 - 2.81 A646    （14-8）

cb = 20.13 A646 - 5.03 A663    （14-9）

cx.c =（1 000 A470 - 3.27 ca - 104 cb）/229    （14-10）

式中：ca、cb—葉綠素 a、b 的濃度；

cx.c一類胡蘿卜素的總濃度；

A663、A645 和 A470—葉綠體色素提取液在波長(zhǎng) 663 nm、646 nm 和 470 nm 下的消光度。由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)計(jì)算公式也有所不同。葉綠素 a、葉綠素 b 在 95% 乙醇中最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為 665 nm 和 649 nm，類胡蘿卜素為 470 nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：

ca = 13.95 A665 - 6.88 A649    （14-11）

cb = 24.96 A649 - 7.32 A665    （14-12）

cx.c =（1 000 A470 - 2.05 ca - 114.8 cb）/245    （14-13）