多酚氧化酶（PPO）活性的測定

簡介

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PP0）廣泛存在于植物組織中，可以氧化酚類物質為醍類物質，但在正常組織中這一反應并不經常發生，如果組織受損，反應便可發生，如蘋 果、茄子創面的褐變。另外，當植物感病時，多酚氧化酶活性明顯升高。因此，酚類物質含量和多酚氧化酶活性測定是植物抗性生理研究中經常用到的一個指標。本實驗的目的在于學習測定多酚氧化酶活性的方法、原理及操作技術。

原理

多酚氧化酶催化分子態氧將酚類化合物如鄰苯二酚（兒茶酚）氧化為醍類物質， 所生成的產物（鄰醍）在525 nm波長處有最大吸收峰，其吸光值與產物生成量呈正相關，所以可據此測定多酚氧化酶的活性。

材料與儀器

材料：馬鈴薯塊莖等。

試劑： 0.5 mol · L-1 pH 5.5磷酸緩沖液，0.1 mol · L-1鄰苯二酚溶液，20% 三氯乙酸。

器材：分光光度計，離心機，研缽，容量瓶，試管等。

步驟

多酚氧化酶（PPO）活性的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 酶液提取：取5 g洗凈去皮的馬鈴薯塊莖，切碎，放入研缽中。加適量磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉入離心管中，3 000 r · min-1離心10 min,上清液轉入25 mL 容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸緩沖液再提取2次，上清液并入容量瓶，定容至刻度。低溫下保存備用。

2. 酶活測定：取4支試管（2支對照，2支測定）按表41 -1加入試劑。37°C水浴中保溫 10 min,到時間后立即加入2 mL 20% 的三氯乙酸，終止酶的反應。反應液4 000 r ·min，離心10 min，收集上清液，并適當稀釋，于525 nm波長下測定其吸光值。

3.結果計算：多酚氧化酶活性單位（U）定義為1 g鮮樣1 min內吸光值變化0.01所需的酶量。

式中：△A—反應時間內吸光值的變化；

W—實驗材料鮮重，g；

t一反應時間，min；

D一稀釋倍數。

注意事項

植物樣本在處理前勿碰傷搓揉。