核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的測定

簡介

核酮糖-1，5-二磷酸狡化酶/加氧酶 (Rubisco) 是光合作用的重要調(diào)節(jié)酶，具有雙重作用。一是在 Calvin 循環(huán)中催化 CO2 的固定，二是能催化將 O2 加在核酮糖-1，5-二磷酸上。其活性是反映植物葉片生長狀態(tài)、發(fā)育程度以及光合碳同化能力的重要生理指標(biāo)。在植物衰老或遭受逆境時，酶活性呈下降趨勢。本實(shí)驗(yàn)了解其在光合作用中的作用，并熟悉 Rubi-sco 活性測定方法。

原理

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的測定的基本原理是核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶催化 1 分子的核酮糖-1， 5-二磷酸（RuBP） 與 1 分子的 CO2 結(jié)合，產(chǎn)生 2 分子的 3-磷酸甘油酸 （PGA），PGA 可通過 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸，并使 NADH 氧化，其反應(yīng)如下：

由上式可知 1 分子 CO2 被固定，就有 2 分子 NADH 被氧化。因此，根據(jù) NADH 氧化的量就可計(jì)算核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶的活性，而由 340 nm 吸光度的變化可計(jì)算 NADH 氧化的量。為了使 NADH 的氧化與 CO2 的固定同步，從而需要加入磷酸肌酸（Cr~P）和磷酸肌酸激酶的 ATP 再生系統(tǒng)。

核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶催化將 O2 加在核酮糖-1，5-二磷酸 （RuBP）的 C-2 位置上，生 成 1 分子的磷酸乙醇酸和 3-磷酸甘油酸。Rubisco 加氧反應(yīng)是典型的單加氧反應(yīng)，將 CO2 的 2 個氧原子摻入 H2O 和磷酸乙醇酸中，因而加氧酶的活性可用氧電極法以氧的消耗來確定。另外，RuBP 在有 MS2+ 離子參與的酶的加氧反應(yīng)中首先被烯醇化，這時 RuBP 的 C-2 位置被調(diào)整為 1 個負(fù)碳離子，當(dāng)與分子氧反應(yīng)后形成過氧化離子，然后電子又從氧回到烯醇化的 RuBP 再生成負(fù)碳離子并產(chǎn)生單線態(tài)氧，而這單線態(tài)氧可以利用發(fā)光光度計(jì)來檢測。發(fā)光光 度計(jì)法測定加氧酶活性比氧電極法靈敏度高 70 倍。但如果要測定 Rubisco 的加氧活性的絕對值，則要用氧電極法先行標(biāo)定。

材料與儀器

材料：菠菜、小麥及水稻等植物葉片。

試劑：

5 mmol?L-1 NADH；25 mmol?L-1 RuBP；0.2 mol?L-1 NaHCO3。

提取介質(zhì)：40 mmol?L-1 Tris-HCl 緩沖液（pH 7. 6），內(nèi)含 10 mmol?L-1 MgCl2 0.25 mmol?L-1 EDTA、5 mmol?L-1 谷胱甘肽。

反應(yīng)介質(zhì)：100 mmol?L-1 Tris-HCl 緩沖液（pH 7. 8），內(nèi)含 12 mmol?L-1 MgCl2 和 0.4 mmol?L-1 EDTA-Na2；160 U?mL-1 磷酸肌酸激酶溶液；160U?mL-1 油醛-3-酸脫氫酶溶液；50 mmol?L-1 ATP；50 mmol?L-1 磷酸肌酸；160 U?mL-1 磷酸甘油酸激酶溶液。

提取緩沖液：100 mmol?L-1 Tris-HCl（pH7.8）；1 mmol?L-1 EDTA；20 mmol?L-1 KC1。

重懸緩沖液：25 mmol?L-1 Tris-HCl（pH7.8）；1 mmol?L-1 EDTA；5 mmol?L-1 疏基乙醇；20 mmol?L-1 KCl。

氧電極法反應(yīng)液：100 mmol?L-1 Tris-HCl（pH8.2）；0.4 mmol?L-1 EDTA ；20 mmol?L-1 MgCl2。

發(fā)光光度計(jì)法反應(yīng)液：50 mmol?L-1 Tris-HCl（pH8.0）；1.0 mmol?L-1 MnCl2 ； 1.0 mmol?L-1 NaHCO3。

亞硫酸鈉；0.1 mmol?L-1 二硫蘇糖醇（DTT）；硫酸鉉；NaCI；10 mmol?L-1 RuBP 儲存液（pH6.5）。

器材：

① 紫外分光光度計(jì)
② 冷凍離心機(jī)
③ 組織搗碎機(jī)
④ 移液管
⑤ 秒表
⑥ 氧電極測氧裝置
⑦ FG-300 型發(fā)光光度計(jì)

步驟

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活性的測定的基本過程可分為如下幾步：

（一）核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶/加氧酶裁化活性的測定

1. 酶粗提液的制備：取新鮮菠菜葉片 10 g，洗凈擦干，放勻漿器中，加入 10 mL 預(yù)冷的提取介質(zhì)，高速勻漿 30 s，停 30 s，交替進(jìn)行 3 次；勻漿經(jīng) 4 層紗布過濾，濾液于 20 000 g 4 ℃ 下離心 15 min，棄沉淀；上清液即酶粗提液，置 0 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/span>

2. RuBPCase 活力測定：按表 15-1 配制酶反應(yīng)體系。

3. 將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸憎水為空白，在紫外分光光度計(jì)上 340 nm 處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值。將 0. 1 mL RuBP 加入比色杯內(nèi)，并馬上計(jì)時，每隔 30 s 測 1 次吸光度，共測 3 min。以零點(diǎn)到第一分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對值計(jì)算酶活力。

由于酶提取介質(zhì)中可能存在 PGA，會使酶活力測定產(chǎn)生誤差，因此除上述測定外，還需

做一個不加 RuBP 的對照。對照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同，不同之處只是把酶提取介質(zhì)放在最后添加，添加后馬上測定此反應(yīng)體系在 340 nm 處的吸光度，并記錄前一分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計(jì)算酶活力時應(yīng)減去這一變化量。

4. 結(jié)果計(jì)算

式中：?A—反應(yīng)最初 1 min 內(nèi) 340 nm 處吸光度變化的絕對值（減去對照液最初 1 min 的變化量）；

N一稀釋倍數(shù)；

6.22—每微摩爾 NADH 在 340 nm 處的吸光系數(shù)；

2—表示每固定 1 mol CO2 有 2 mol NADH 被氧化；

?t—測定時間 1 min；

d—比色皿光程，cm。

（二）核酮糖-1，5-二磷酸狡化酶/加氧酶加氧活性的測定

1.Rubisco 的提取及純化：取 5~7 g 葉片加入 10 mL 預(yù)冷到 4 ℃ 的提取緩沖液，勻漿， 15 000 g 離心 10 min，取上清液備用。

將上述得到的粗提液用 40% 飽和度的硫酸鉉進(jìn)行分步沉淀，冷凍離心 20 min（4 ℃， 8 000 g）。然后取上清液，加 70% 的飽和度硫酸鉉，冷凍離心 20 min（4 ℃，10 000 g）后取沉淀，用少量重懸緩沖液溶解，再經(jīng) Sephadex G-25 脫鹽后上 DEAE（DE 52）柱，用含 0.0~0.5 mmol?ml-1 NaCl 的重懸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分步收集 0.20~0.25 mmol?ml-1 NaCl。70% 硫酸鉉沉淀，于一 20 ℃ 保存，待測活性前以 8 mg?ml-1 溶于重懸緩沖液中備用。

2. 氧電極測定法測定 Rubisco 加氧酶活力：將 2 mL 氧電極法反應(yīng)液，在大氣中攪拌 10 min， 使溶液中的溶解氧與大氣平衡。然后把電極放在反應(yīng)室上，調(diào)節(jié)測氧儀的靈敏度旋鈕，使記錄儀至滿刻度，再加入 0.1 mL 飽和的亞硫酸鈉，除盡水中的氧，指針退回到接近 0 點(diǎn)，根據(jù)指針退回的格數(shù)和 25 ℃ 水的溶解氧量，就可以計(jì)算出每格記錄紙所代表的溶氧量。 25 ℃ 時的水溶氧量為 0.26 μmol?mL-1。每格記錄紙代表的溶氧量計(jì)算如下：

將 2 mL 空氣飽和的溶液加入反應(yīng)室，加入 0.1 mL 酶液（8 mg?ml-1），在 25 ℃ 保溫 10 min 后，裝好電極，記錄由 DTT 氧化所消耗氧的空白速度，最后加入 0.01 mL RuBP 儲存液開始反應(yīng)，記錄反應(yīng)速度，反應(yīng)速度以每分鐘多少格子記錄紙來表示。加氧酶的活力就可通過以下公式計(jì)算：

3. 發(fā)光光度計(jì)法測定 Rubisco 加氧酶活力：先在比色杯中加入 25 μL RuBP 儲存液，放入發(fā)光光度計(jì)反應(yīng)暗室中，然后將 1.4 mL 發(fā)光光度計(jì)法反應(yīng)液中加有 10 μL 酶液的混合液在 25 ℃ 保溫 10 min，然后注入比色杯開始反應(yīng)，自動記錄發(fā)光曲線。發(fā)光強(qiáng)度以峰高來表示（mm）。

注意事項(xiàng)

1. 提取Rubisco應(yīng)在冰浴條件下進(jìn)行。

2. RuBP很不穩(wěn)定，特別在堿性環(huán)境下，因而應(yīng)在pH5.0-6.5之間于 - 20 ℃ 保存，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。