磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定

簡介

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定是了解磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）梭化酶的功能，熟悉酶偶聯法測定 PEP 稜化酶活性的方法。

原理

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性的測定的基本原理是PEP梭化酶是 C4 植物和 CAM 植物固定 CO2 的關鍵酶。在 Mg2+ 存在下，PEP 梭化酶可催化 PEP 與 HCO3- 形成草酰乙酸（OAA），后者在蘋果酸脫氫酶（MDH）催化下，可被 NADH 還原為蘋果酸（Mal）。其反應如下：

通過在 340 nm 處測定反應體系吸光度的變化，計算出 NADH 的消耗速率，進一步推算出 PEP 梭化酶的活性。

材料與儀器

材料：玉米、高粱等 C4 植物的葉片。

試劑：

提取緩沖液：0.1 mol?L-1 Tris-H2SO4 緩沖液（pH7.4），內含 7 mmol?L-1 疏基乙醇、1 mmol?L-1 EDTA、5% 甘油；

平衡緩沖液：10 mol?L-1 Tris-H2SO4 緩沖液（pH8. 2），內含 0.2 mmol?L-1 EDTA、 0.2 mol?L-1 DTT（二硫蘇糖醇）、5% 甘油；

反應緩沖液：0.1 mol?L-1 Tris-H2SO4 緩沖液（pH9.2），內含 0.1 mol?L-1 MgCl2；

反應試劑：100 mmol?L-1 NaHCO3、40 mmol?L-1 PEP、1 mg?L-1 NADH（pH8.9）、蘋果酸脫氫酶（MDH）。

器材：

① 紫外分光光度計

② 冷凍離心機

③ 組織搗碎機

④ Sephadex G-25 柱（2 cm × 45 cm）

⑤ DEAE（二乙氨乙基）-纖維素（DE-52，1 cm × 30 cm）柱

⑥ 紫外監測儀

⑦ 部分收集器

⑦ 蠕動泵

步驟

磷酸烯醇式丙酮酸裝化酶活性的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 粗酶液提取

將葉片洗凈并吸去水分，去掉中脈。稱取 20 g，放入冰箱中過夜，次日剪碎 后放入組織搗碎機中，加入提取緩沖液（已預冷）80 mL，20 000 r/min 勻漿 2 min（運行 30 s、間歇 10 s，反復勻漿），用 4 層紗布過濾，取濾液于高速冷凍離心機上 15 000 g 離心 10 min，上清液即為 PEP 梭化酶的粗酶提取液。

2. 酶的純化

(1) 硫酸鉉分步沉淀：將上述粗酶液裝入燒杯，于攪拌器上攪拌，緩慢加入固體硫酸鉉粉末達到 35% 飽和度，在冰箱中靜置 1 h， 于 15 000 g 下離心 10 min，取上清液再緩慢加入固體硫酸鉉粉末達到 55% 飽和度，冰箱靜置 1 h，再于 15 000 g 下離心 10 mm，棄上清液，沉淀用平衡緩沖液 8 mL 復溶。

(2)Sephadex G-25 柱層析：先用平衡緩沖液平衡 Sephadex G-25 柱（2 cm × 45 cm）。將上述復溶溶液上柱，壓樣 2 次，用平衡緩沖液洗脫，洗脫速度為 50 mL?h-1，通過檢測儀，收集有酶活性的部分，于 15 000 g 下離心 10 min，上清液即為 PEP 梭化酶的部分純化酶液。

(3)DEAE-纖維素柱層析：把轉型的 DEAE-52 裝入 1 cm × 30 cm 的層析柱，用平衡緩沖液平衡 2 h，將上述已部分純化的酶液上 DEAE-52 柱，壓樣 2 次，用平衡緩沖液洗脫，通過紫外檢測儀后收集。再用平衡緩沖液配制 0~0.6 mol?L-1 NaCl 溶液進行連續性梯度洗脫（速度為 30 mL?h-1），收集有酶活性的部分即為純化的 PEP 侵化酶，用于酶活的測定。

3. 酶活測定

取試管 1 支，依次加入 1.0 mL 反應緩沖液，0.1 mL 40 mmol?L-1 PEP，0.1 mL 1 mg?mL-1 NADH（pH8.9），0.1 mL 蘋果酸脫氫酶和 0.1 mL PEP 梭化酶（已純化的提取液），1.5 mL 蒸餾水，在所測溫度（如 30 ℃）下恒溫水浴保溫 10 min，在 340 nm 下測定吸光度值 A340（A0）；然后加入 0.1 mL 100 mmol?L-1 NaHCO3 啟動反應，立即計時，每隔 30 s 測定一次吸光度值（A1），記錄其變化。

4. 實驗結果

式中：V—測定混合液總體積，3 mL；

L 一比色杯光程，cm;

0.1 一反應混合液中酶液用量，mL；

m 一酶液稀釋倍數；

△A = A0 - A1；

a一 NADH 于 340 nm 處的摩爾消光系數（6.22 × 103 mol-1?cm-1）。

注意事項

1. 酶提取過程應在 0~4 ℃ 下進行。

2. 測定時的酶液用量需事先試驗，蘋果酸脫氫酶的用量視 PEP 梭化酶活性大小而定，也可事先通過實驗確定最佳用量。