抗壞血酸過氧化物酶 (AsA-POD)活性的測定

簡介

了解抗壞血酸過氧化物酶 (AsA-POD) 的作用。掌握分光光度法測定抗壞血酸過氧化物酶活性的方法。

原理

抗壞血酸過氧化物酶 (AsA-POD)活性的測定的基本原理是AsA-POD 催化 AsA 與 H2O2 反應，使 AsA 氧化成單脫氫抗壞血酸 (MDAsA)。 隨著 AsA 被氧化，溶液中 290 nm 波長下的消光值 (A290) 下降，根據(jù)單位時間內A290減少值, 計算 AsA-POD 活性。AsA 氧化量按消光系數(shù) 2.8(mmol?L-1?cm-1) 計算，酶活性可用每克鮮重每小時氧化 AsA 的物質的量 (μmol ?g-1?h-1) 表示。

材料與儀器

材料：新鮮果實、蔬菜，植物根、莖、葉等。

器材：離心機，紫外分光光度計，研缽，試管等。

試劑：

①K2 HPO4-KH2PO4 緩沖液 (pH7. 0, 內含 0. 1 mmol ? L-1 EDTA-Na2 )

②0. 3 mmol ? L -1 AsA

③20 μmol ? L -1 AsA

④0.06 mmol ? L-1 H2O2

步驟

抗壞血酸過氧化物酶 (AsA-POD)活性的測定的基本過程可分為如下幾步：

1. 酶液制備：取 1.0 g 植物葉片剪碎，按 1 ： 3(W/V) 加入預冷的 50 mmol?L1 K2 HPO4-KH2PO4 緩沖液進行研磨提取，用兩層紗布過濾，濾液在 4 000 r ? min'1 下離心 10 min, 上清液作酶粗提液供測定。

2. 酶活性測定：3 mL 反應混合液中含 50 mmol ? L-1, K2 HPO4-KH2PO4 緩沖液 (pH7.0),0.l mmol ? L-1 EDTA-Na2， 0. 3 mmol ? L-1 AsA, 0. 06 mmol ? L-1 H2O2 和 0. 1 mL 酶液。加入 H2O2 后立即在 20°C 下測定 10?30 s 內的 A290 變化，計算單位時間內 AsA 減少量及酶活性，以 1 min 內人 29。減少 0.01 的酶量為 1 個酶活單位 (U)。

抗壞血酸過氧化物酶活力 [U?(g? min)t] = WUoTl X t
式中:AA290——反應時間內吸光度的變化；
Vt—粗酶提取液總體積，mL；
V1一測定用粗酶液體積，mL；
FW—樣品鮮重,g；
0. 01—A290 每下降 0. 01 為 1 個酶活單位 (U)；
t 一反應時間，min。

注意事項

1. 酶液的提取過程要盡量在低溫條件下進行。

2.要在反應開始前加入，不能直接加入。