苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定

簡(jiǎn)介

苯丙氨酸解氨酶（PAD 對(duì)植物體的木質(zhì)素、植保素、類(lèi)黃酮、花青素等次生物質(zhì) 的形成起重要的調(diào)節(jié)作用，且與植物的抗病作用有一定的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)了解測(cè)定苯丙氨酸解氨酶活性的原理和方法。

原理

苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定的基本原理是苯丙氨酸解氨酶是植物次生代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶。它催化 L-苯丙氨酸的脫氨反應(yīng). 釋放氨而形成反式肉桂酸。根據(jù)產(chǎn)物反式肉桂酸在波長(zhǎng) 290 nm 處吸光度的變化，可以測(cè)定該酶的活性。

材料與儀器

材料：黃化水稻幼苗。

器材：冷凍高速離心機(jī)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，旋渦混合器，恒溫水浴鍋等。

試劑：

①0. 1 mol ?L-1硼酸緩沖液（pH 8. 8）

②0. 02 mol ? L-1 L-苯丙氨酸：稱(chēng)取 3.33 g L-苯丙氨酸溶于 1 000 mL 0. 1 mol?L-1 硼酸緩沖液（pH 8. 8）

③7 mmol - 巰基乙醇硼酸緩沖液：0. 11 mL 藐基乙醇用 0. 1 mol?L-1 硼酸緩沖液溶解，并定容至 200 mL

④聚乙烯毗咯烷酮（PVP）

步驟

苯丙胺酸解氨酶（PAL）活性的測(cè)定的基本過(guò)程可分為如下幾步：

1. 酶液制備：稱(chēng)取黃化水稻幼苗 0.5 g, 先加 1.5 mL 預(yù)冷的提取液（即 7 mmol ? L-1 蔬基乙醇硼酸緩沖液）、過(guò)量的聚乙烯毗咯烷酮（PVPX）（但不能太多，否則不易研磨）、少量石英砂在冰浴下研磨成漿，再加 3.5 mL 預(yù)冷的提取液使其終體積為 5 mL。于 12 000 g 4°C 下離心 15 min, 用吸管吸取上清液，即粗酶液。

2. 酶活測(cè)定：
反應(yīng)液包括：①0.02 mol? L-1 L-苯丙氨酸 1 mL；
②0.1 mol ?L -1 硼酸緩沖液（pH 8. 8）2 mL；
③0.1 mL 粗酶液。
（對(duì)照以 0. 1 mL 疏基乙醇緩沖液代替酶液）
反應(yīng)液用渦旋混合器混勻后立即在 290 nm 處測(cè)起始吸光度值，并精確計(jì)時(shí)。（每一樣品重復(fù)兩組）將測(cè)定后的各管于 30°C 水浴保溫 30 min, 再于 290 nm 處測(cè)定各管的吸光度值。本實(shí)驗(yàn)以每 30 min 在波長(zhǎng) 290 nm 處吸光度值增加 0. 01 所需酶量為 1 個(gè)單位（U）。
苯丙氨酸解氨酶活性（U - g -1鮮重）=
式中 a —測(cè)定時(shí)的酶液用量，mL；
V—酶液總體積，mL；
W—樣品重，g。
（苯丙氨酸解氨酶活性也可以 U ? mg-1 蛋白表示. 蛋白質(zhì)含量可用考馬斯亮藍(lán) G-250 法測(cè)定，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)）。