植物體內游離脯氨酸含量的測定
簡介
植物在正常條件下，游離脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時，游 離脯氨酸便會大量積累，并且積累指數與植物的抗逆性有關。因此，脯氨酸可作為植物抗逆 性的一項生化指標。本實驗學習游離脯氨酸含量測定的原理和方法。
原理
植物體內游離脯氨酸含量的測定的基本原理是釆用磺基水楊酸提取植物體內的游離脯氨酸，不僅大大減少了其他氨基酸的干 擾，快速簡便，而且不受樣品狀態 (干或鮮樣) 限制。在酸性條件下，脯氨酸與茄三酮反應生成 穩定的紅色縮合物，用甲苯萃取后，此縮合物在波長 520 nm 處有一最大吸收峰。脯氨酸濃度 的高低在一定范圍內與其吸光度成正比。
材料與儀器
材料: 植物葉片，包括新鮮葉片和萎蔦葉片。
器材: 天平，分光光度計，水浴鍋，漏斗，20 mL 大試管，20 mL 具塞刻度試管，5? 10 mL 注射器或滴管。
試劑：
①3% 磺基水楊酸溶液；
②甲苯；
③2. 5% 酸性站三酮顯色液；
④冰乙酸和 6 mol ?L -1磷酸以 3 : 2 混合 (作為溶劑進行配制，在 4°C 下 2?3 天有效)；
⑤脯氨酸標準溶液：準確稱取 25 mg 脯氨酸，用蒸餡水溶解后定容至 250 mL, 其濃度為 100 μg ? mL-1。再取此液 10 mL, 用蒸僭 水稀釋至 100 mL, 即成 10 μg?mL-1 的脯氨酸標準液。
步驟
植物體內游離脯氨酸含量的測定的基本過程可分為如下幾步：
1 . 標準曲線制作：
(1) 取 7 支具塞刻度試管按表 45-1 加入各試劑。混勻后加玻璃球塞，在沸水中加熱 40 min。
(2) 取岀并冷卻后，向各管加入 5 mL 甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質。靜置待分層后吸 取甲苯層，以。號管為對照在波長 520 nm 下比色。
(3) 以吸光值為縱坐標，脯氨酸含量為橫坐標, 繪制標準曲線，求線性回歸方程。
表 45-1 各試管中試劑加入量
| 試劑 | 管號 | ||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 標準脯氨酸量/mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2.0 |
| H2O/mL | 2 | 1.8 | 1.6 | 1.2 | 0.8 | 0.4 | 0 |
續表 45-1
| 試劑 | 管號 | ||||||
| 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 冰乙酸/mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 酸性帶三酮顯色液/mL | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 脯氨酸含量//g | 0 | 2 | 3 | 8 | 12 | 16 | 20 |
2 ?樣品游離脯氨酸含量測定：
（1） 脯氨酸提取：取不同處理的剪碎混勻小麥葉片 0.2?0.5 g（干樣根據水分含量酌減）， 分別置于大試管中，加入 5 mL 3% 硝基水楊酸溶液?管口加蓋玻璃球，于沸水浴中浸提 10 min。
（2） 測定：取出試管，待冷卻至室溫后，吸取上清液 2 mL, 加 2 mL 冰乙酸和 3 mL 酸性站 三酮顯色液，于沸水浴中加熱 40 min, 下步操作按標準曲線制作方法進行甲苯萃取和比色。
（3） 結果計算：從標準曲線中查出測定液中脯氨酸含量. 按下式計算樣品中脯氨酸含量的 百分數。
脯氨酸含量保 g - g7（干或鮮樣）］=紡法
式中：刀一提取液中脯氨酸含量g~E_由標準曲線求得；
V—提取液總體積，mL；
A 一測定時所吸取的體積，mL；
W—樣品重，g。
注意事項
1. 葉片萎薦時間一般 3?4 h, 不能太久，否則脯氨酸積累多，樣品測定需稀釋。
2. 酸性曲三酮顯色液與脯氨酸溶液現配現用效果好。
