RNA 干擾技術

簡介

轉錄后基因沉默機制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被稱為RNA干擾（RNAi），與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈 RNA（dsRNA）導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。

目前為止較為常用的制備 siRNA的方法有化學合成、體外轉錄、長片段dsR-NA經RNA酶I類降解（如Dicer，E.coli的RNA酶II）體外制備 siRNA，以及通過 siRNA 表達載體或者病毒載體、PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。

前面的3種方法主要都是體外制備siRNA，并且需要專門的RNA轉染試劑將 siRNA轉到細胞內。

而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于從轉染到細胞的DNA模板中在體內轉錄得到siRNA。

這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

而將制備好的siRNA、siRNA表達載體或表達框架轉染至真核細胞中的方法不外乎以下幾種：

磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物（polybrene）、機械法［如顯微注射和基因槍（biolistic particle）］和陽離子脂質體介導的轉染。

原理

siRNA 表達框架制備siRNA法的基本原理是：siRNA表達框架（siRNA expression cassettes，SEC）是一種由PCR得到的 siRNA表達模板，包括一個RNA聚合酶I啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA聚合酶II終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中，具體過程如圖所示。

陽離子脂質體介導的轉染的基本原理為：脂類的頭部基團之間的離子相互作用，脂類的頭部基團攜帶很強的正電荷，可中和DNA磷酸基團的負電荷，因而陽離子脂類可以與DNA自動形成可與細胞膜融合的單層外殼，從而將DNA導入細胞內。

材料與儀器

器材：

①PCR儀、（滅菌）

②細胞培養箱、恒溫水浴箱

③紫外分光光度計

④顯微鏡

⑤35 mm細胞培養皿

⑥冷凍離心機

⑦0.2 ml和1.5 ml聚苯乙烯 Eppendorf 管

試劑：

①材料：指數生長的哺乳動物細胞培養物

②siRNA表達框架的PCR模板、上游引物、dNTP混合液、Taq DNA聚合酶、10 x PCR反應緩沖液

③Lipofectamine 2000

④細胞生長培養基、無血清培養基、0.25％ 胰蛋白酶

⑤3 mol／L CH3COONa（pH 5.2）

⑥TE（pH 8.0）

⑦無水乙醇、70％ 乙醇

步驟

RNAi的基本過程可分為如下幾步：

(一) 試劑配制

（1）上游引物 濃度20 μmol／L。

（2）dNTP混合液 將 dATP、dGTP、dCTP和dTTP鈉鹽各100 mg合并，加去離子水2 ml溶解，用0.1 mol／L NaOH 調節 pH至7.0～7.5，使其濃度為5 mmol／L，分裝后-20 ℃ 保存。現也有商品化的混合液（各2 mmol／L）供應。

（3）Taq DNA聚合酶 5 U／μl，使用時其在50 μl反應體積終濃度為1～2.5 U。

（4）10 x PCR反應緩沖液 500 mmol/L KCI，100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4), 15 mmol/L MgCl2。

（5）10 x D-Hanks緩沖液 NaCl 80.0 g，Na2HPO4·2H2O 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，三蒸水加至1000 ml，高壓滅菌后4 ℃ 保存。用時按比例稀釋。

（6）0.25％ 胰蛋白酶 胰蛋白酶0.25 g，D-Hanks緩沖液加至100 ml溶解，過濾除菌，4 ℃保存，用前在37 ℃下回溫。

（7）無血清培養基（RPMI-1640 基礎培養基）三蒸水900 ml，RPMI-1640粉1包（10.4 g），磁場攪拌至完全溶解，加入NaHCO3 2.0 g，完全溶解后加水定容到1000 ml，過濾除菌分裝。

（8）細胞生長培養基（RPMI-1640生長培養基）RPMI-1640基礎培養基添加10％ 小牛血清。

(9) TE 10 mmol/L Tris-HC1，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

（10） 3 mol／L CH3COONa（pH 5.2） 800 ml H2O溶解408.3 g CH3COONa，用冰醋酸 調節pH至5.0，用H2O定容至1 L，高壓蒸汽滅菌。

(二) siRNA的設計（RNAi目標序列的選取原則）

（1）從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二聯序列，并記下其3＇端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。

有研究結果顯示（G＋C）含量在45％～55％左右的siRNA要比那些（G＋C）含量偏高的更為有效。

建議在設計siRNA時不要針對5＇和3＇端的非編碼區（untranslated regions，UTR），原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響 siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA，從而影響siRNA的效果。

（2）將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人、小鼠、大鼠等）進行比較，排除那些和其他編碼序列／EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih／gov／BLAST）。

（3）選出合適的目標序列設計并分別合成正義RNA和反義RNA的下游引物，合成濃度20 μmol／L。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，并合成相應的引物，以找到最有效的siRNA序列。

(三) PCR反應

（1）向一個Eppendorf管中加入10 x PCR緩沖液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 ul，上游引物1.5 μl，下游引物（S）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌去離子水補足50 μl；

另一個 Eppendorf 管中加入10xPCR緩沖液5 μl，5 mmol／L dNTP混合液2 μl，上游引物1.5 μl，下游引物（AS）1.5 μl，模板DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌去離子水補足50 μl。

（2）在PCR儀上進行兩步擴增反應：94 ℃，變性30 s；72 ℃，90 s，35個循環。

(四) PCR產物的純化

（1）分別在兩種PCR產物中加入1／5體積的3 mol／L CH3COONa和2倍體積的預冷無水乙醇，充分混勻后，4 ℃放置30 min。

（2）4 ℃，14000 g離心5 min液，吸去上清液，然后用70％ 乙醇洗滌沉淀的DNA，再次離心樣品，棄去上清液，空氣干燥沉淀。

（3）將沉淀下來的DNA溶于TE，測OD值。

(五) 轉染

（1）轉染前一天，0.25％ 胰蛋白酶消化細胞并計數，以5x104個細胞／平皿的密度將細胞平鋪于35 mm細胞培養皿上，使其在轉染日密度不低于70％。加3 ml含血清、不含抗生素的生長培養基，于含5％～7％ CO2的37℃ 培養箱內孵育20～24 h。

（2）在一個聚苯乙烯試管內用100 μl無血清培養基稀釋1.0～2.0 μg PCR產物。

（3）在另一個聚苯乙烯試管內用100 μl無血清培養基稀釋2～5 μl Lipofectamine2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后，在30 min內同稀釋的PCR產物混合。保溫時間過長會降低活性。

（4）混合稀釋的PCR產物和稀釋的 Lipofectamine2000，混勻后在室溫下孵育20 min。

（5）孵育DNA-脂質體溶液時，用無血清培養基將要轉染的細胞洗滌3次，然后向平皿中加入0.5 ml無血清培養基，將組織培養皿再放入含5％～7％CO2的37℃培養箱內孵育。

（6）直接將復合物加入到平皿中，搖動平皿，輕輕混勻。

（7）將平皿放在含5％～7％ CO2的37 ℃培養箱內孵育24～48 h，無需去掉復合物或更換培養基，或者在4～5 h后更換生長培養基也不會降低轉染活性。

（8）在細胞中加入復合物24～72 h后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。

對穩定表達，在開始轉染1d后將細胞傳代至新鮮培養基中，2d后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。

(六) 實驗結果及分析

根據所要沉默的基因其表達的蛋白質的性質，選擇相應的方法檢測蛋白質的表達情況。

注意事項

1．要設立陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。

通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。

2．避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致 siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在，如皮膚、頭發、所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，因此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3．健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。為了優化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

4．避免使用抗生素

從細胞種植到轉染后72h期間避免使用抗生素?？股貢诖┩傅募毎蟹e累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。

這種情況下，可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

5．通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件

對大多數細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48h后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以致死亡。

6．通過標記siRNA來優化實驗

熒光標記的siRNA 能用來分析 siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。