桿狀病毒表達系統的建立

簡介

桿狀病毒是雙鏈 DNA 病毒，主要感染昆蟲，也感染體外昆蟲細胞系，對人畜無毒害。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）是目前宿主最廣、應用最多的桿狀病毒，它與草地貪夜蛾 Sf21 細胞系建立了廣為應用的 Bac-to-Bac 桿狀病毒表達系統。

該系統表達的外源基因，表達量多，能進行產物加工、修飾和折疊，形成有生物活性的產物，是當今基因工程領域中的四大表達系統之一，已表達上千種外源基因。

原理

Bac-to-Bac 系統的技術原理是該系統主要包括供體質粒 pFastBac，大腸桿菌 DH5a、DH10Bac，昆蟲 Sf21 細胞等。供體質粒 pFastBac 上有 Tn7 的左右臂序列，兩臂之間是病毒多角體基因 polyhedrin 的強啟動子及其下游的多克隆位點、polyA位點，慶大霉素抗性基因等。

將外源基因連接到供體質粒上，轉化 DH5a 感受態細胞，提取重組供體質粒，再轉化 DH10Bac 感受態細胞。該細胞含有穿梭質粒 Bacmid 和輔助質粒 helper，Bacmid 上有 F 復制子，卡那霉素抗性基因及 lacZa 肽段編碼基因，LacZa 基因上有細菌轉座子 Tn7 的附著位點 mini-attTn7。重組供體質粒的 Tn7 在 DH10Bac 中 helper 編碼的轉座酶幫助下轉座到 Bacmid 上的 mini-attTn7 位點，干擾了 LacZ 的表達。

因此具有重組 Bacmid 的 DH10Bac 在慶大霉素、卡那霉素、四環素（輔助質粒對四環素有抗性）及含有 X-gal、IPTG 的培養板上形成白色菌落。提取重組 Bacmid，脂質體法轉染昆蟲 Sf21 細胞，在培養液中可獲得重組病毒，重組病毒可繼續感染昆蟲細胞，外源基因隨著病毒擴增而表達。供體質粒 pFastBacDUAL 有兩個克隆位點，一個位于 poly-hedrin 的啟動子下游，一個位于 p10 啟動子下游，用它構建的重組病毒感染細胞后表達兩種蛋白。

有的學者把綠色熒光蛋白基因構建到 p10 啟動子下游，表達的綠色熒光作為標記蛋白。

材料與儀器

器材：

① 細胞培養設備，恒溫培養箱

② 相差顯微鏡

③ 離心機

試劑：

① 供體質粒 pFastBac 或 pFastBacDUAL，DH5aDH10Bac，感受態細胞 Sf21 細胞

② LB 液體、固體培養基、Luria 固體培養基、SOC 培養基、Grace's培養液

③ 限制性內切酶

④ 連接酶

⑤ 質粒提取試劑盒

⑥ lipofectin

步驟

昆蟲桿狀病毒表達系統的建立的基本過程可分為如下幾步：

（一） 試劑配制

(1) LB 液體培養基：NaCl 10 g，酵母提取物 5 g，蛋白胨 10 g，然后用 NaOH 調節 pH 至 7.0，定容至 1000 mL，103.4 kPa 滅菌 20 min。LB 固體培養基：每升 LB 液體培養基補加瓊脂粉 15 g，滅菌 20 min。

(2) Luria Agar 固體培養基：每升含胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，pH 7.0~7.2，15 lbf/in2，103.4 kPa 滅菌 20 min。

(3) SOC 培養基：先配 SOB 培養基：胰化蛋白胨 2 g，酵母提取物 0.5 g，NaCl 0.05 g，250 mmol/L KCl 溶液 1 mL，定容至 100 mL。然后用 NaOH 調 pH 至 7.0，10 lbf/in2，68.9 kPa 滅菌 30 min，4 ℃ 放置。用時在 10 mL SOB 培養基里加入滅菌的 50 μL 2mol/L 的 MgCl2 溶液及 200 μL 無菌抽濾的1 mol/L 葡萄糖。

(4) Grace's完全培養液：Grace's昆蟲細胞培養基補加碳酸氫鈉 0.35 g/L，lactalbuminhydrolysalate 及 yeastolate 各 3.33 g/L 后用超純水充分溶解，1 mol/L NaOH 調 pH 至 6.0，定容 1 L，無菌抽濾后分裝，-20 ℃ 存放。用時添加胎牛血清至 10％。

（二） 重組供體質粒構建

(1) 連接：選取限制性內切酶如 EcoRI/XhoI 分別酶切供體質粒和外源基因片段，T4 連接酶連接，16 ℃ 過夜。

(2) 轉：DH5a 5 μL 連接液加入到 100 μL 冰浴融化的 DH5a 感受態細胞中，冰浴 30 min，42 ℃ 熱激 60 s，冰上冷卻 2 min，加入 400 μL SOC 培養基，37 ℃，225 r/min 振蕩培養 1 h，離心收集細胞。用適量 SOC 培養基稀釋菌體細胞，涂布在含氨芐青霉素 100 μg/mL，X-gal 100 μg/mL，IPTG 40 μg/mL 的 LB 固體培養基平板上，37 ℃ 倒置培養 24~48 h。

(3) 藍白斑篩選：挑起平板中央數個獨立白斑，PCR 及酶切驗證是否重組了外源基因。

(4) 重組質粒提取：陽性白斑擴增培養，用質粒提取試劑盒提取重組的供體質粒。

（三） 轉座獲得重組 bacmid

(1) 轉化：DH10Bac 1 μL 重組供體質粒稀釋至 10 μL 水中后加入到 100 μL 冰浴融化的 DH10Bac 感受態細胞中，冰浴 30 min，42 ℃ 熱激 45 s，冰上冷卻 2 min。加入 900 μL SOC培養基，37 ℃，225 r/min 振蕩培養 4 h，離心收集細胞，用適量 SOC 培養基稀釋菌體細胞。涂布在含卡那霉素 50 μg/mL，慶大霉素 7 μg/mL，四環素 10 μg/mL，X-gal 100 μg/mL，IPTG40 μg/mL 的 Luria 固體培養基平板上，37 ℃ 倒置培養 24~48 h。

(2) 藍白斑篩選：挑起平板中央數個獨立白斑，PCR 及酶切驗證是否重組了外源基因。

(3) 重組質粒提取：陽性白斑擴增培養，用質粒提取試劑盒提取重組 bacmid。帶 GFP 標記蛋白的重組 pFastBacDUAL。

（四） 轉染

(1) 10 μL cellfectin 加無菌水至 25 μL，輕輕混勻 5 min。

(2) 將 60 ℃ 水浴 1 h（滅活微生物）的 25 μL 重組 Bacmid（對照組用不含外源基因的Bacmid 代替）加入脂質體中，室溫 1 h，期間每隔 10 min 輕彈管底混勻一次。

(3) 將指數生長期的 Sf21 細胞的含血清培養液換成 2 mL 無血清 Grace's 培養液，1 h 后更換 2 mL 新的無血清 Grace's 培養基。并將上述 Bacmid/脂質體混合物輕輕點在培養基上，27 ℃ 靜置培養 5~6 h 后，換 2 mL 含 50 U/mL 慶大霉素和 10％ 胎牛血清的 Grace's 完全培養液。

(4) 27 ℃ 繼續培養 3~5 d 后收集上清培養液，4 ℃ 避光存放，以備感染用。

（五） 感染擴增、收集重組蛋白

(1) Sf21 細胞生長至 80％ 密度時，棄培養液，加入上述收集的轉染后含重組病毒的上清培養液。

(2) 27 ℃ 靜置培養 1.5 h 后，更換 4 mL 新的 Grace 培養液繼續培養 3~5 d，分別收集上清（含芽生病毒 Budded virus，BV）及細胞，進行重組表達產物的純化及鑒定。

(3) 上清中含重組病毒芽生病毒，可離心棄細胞碎片后繼續用于感染。

（六）重組蛋白的檢測 SDS-page 或 Western blotting 法檢測

注意事項

（1）擴增的外源基因的 PCR 產物兩端要有限制性內切酶位點序列，且該序列應與將要連接的供體質粒的限制性內切酶序列一致。

（2）轉化 DH5a 及 DH10Bac 固體培養基平板上的抗生素及 X-gal、IPTG 要涂布均勻，然后放至培養箱半小時后才能使用，否則對菌體細胞毒性大，無法形成菌落。

（3）重組 Bacmid 在與脂質體混合前要用 60 ℃ 水浴滅活，以避免轉染培養時污染。轉染前 Sf21 細胞應換不含血清的 Grace's 培養液，1 h 后更換 2 mL 新的無血清 Grace's 培養基，再加入 Bacmid/脂質體混合物，否則轉染率低。