甲基化特異 PCR

簡介

甲基化特異 PCR 是一種簡便、特異的、敏感的檢測單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組 DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用 3 對特異性的引物對所測基因的同一核苷酸序列進行擴增。擴增產物用 DNA 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。

原理

甲基化特異 PCR 的基本原理是 DNA 經重亞硫酸鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，以處理后的產物作為模板，加入甲基化特異性的引物（primer I）或非甲基化的引物（primer Ⅱ），進行特異性的擴增，只有結合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產物。

材料與儀器

器材：

① PCR儀

② 離心機

試劑：

① 基因組 DNA

② 3 mol/L NaOH 溶液

③ 10 mmol/L、pH5.0 對苯二酚

④ 3 mol/L，pH5.0 NaHSO3

⑤ 3 mol/L NaAc

⑥ 冷乙醇

⑦ TE緩沖液

步驟

甲基化特異PCR的基本過程可分為如下幾步：

（一）引物設計

引物設計的關鍵在于特異引物的設計。引物序列設計在富含胞嘧啶區域以區別亞硫酸氫鈉處理后轉化的非甲基化的 DNA 與未轉化的甲基化的 DNA，在引物的 3' 端，至少含有 3 個 CpG 位點，以保證區別甲基化與非甲基化 DNA。

野生型引物對直接根據基因組的待測序列設計。甲基化引物對與非甲基化引物對分別根據待測序列的 CpG 位點在經亞硫酸氫鈉轉化后的序列設計。野生型引物只能擴增出未經亞硫酸氫鈉處理的基因片段，甲基化引物對與非甲基化引物對只能分別擴增甲基化與非甲基化的基因片段，由此達到檢測基因甲基化的目的。

（二）基因組 DNA 的提取

（1）哺乳動物新鮮組織 DNA 提取

① 切取組織 5 g 左右，剔除結締組織，吸水紙吸干血液，剪碎放人研缽（越細越好）。

② 倒入液氮，磨成粉末，加 10 ml 分離緩沖液（分離緩沖液：10 mmol/L Tris-Cl pH7.4，10 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA）。

③ 加1 ml 10% SDS，混勻，此時樣品變得很黏稠。

④ 加 50 μl 或1 mg 蛋白酶 K，37 ℃ 保溫 1~2 h，直到組織完全解體。

⑤ 加1 ml 5 mol/L NaCl，混勻，5 000 r/min 離心數秒鐘。

⑥ 取上清液于新離心管，用等體積酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）抽提。待分層后，3 000 r/min 離心 5 min。

⑦ 取上層水相至干凈離心管，加 2 倍體積乙醚抽提（在通風情況下操作）。

⑧ 移去上層乙醚，保留下層水相。

⑨ 加 1/10 體積 3 mol/L NaAc，及 2 倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀 DNA。室溫下靜置 10~20 min，DNA 沉淀形成白色絮狀物。

⑩ 用玻棒鉤出 DNA 沉淀，在 70% 乙醇中漂洗后，在吸水紙上吸干，溶解于 1 ml TE 中，-20 ℃ 保存。

? 如果DNA溶液中有不溶解顆粒，可在 5 000 r/min 短暫離心，取上清；如要除去其中的 RNA，可加 5 μl RNaseA（10 μg/μl），37 ℃ 保溫 30 min，用酚抽提后，按步驟 ⑨，⑩ 重沉淀 DNA。

（2）細胞中提取 DNA

① 將處理過的細胞棄去培養基，用 PBS 洗絳后用胰酶消化。

② 加入 PBS，收集細胞于15 ml 離心管中。

③ 1 000 r/min 離心 5 min。

④ 棄上清，用PBS重懸，轉移至 1.5 ml 離心管中。

⑤ 5 000 r/min 離心 1 min，棄上清，用 1 倍體積的裂解液（含 0.2 mg/ml 蛋白酶 K，150 mmo/L NaCl，40 mmol/L EDTA，10 mo/L Tris-HCl，1% SDS，pH8.0）溶解沉淀。

⑥ 37 ℃ 溫浴 6 h。

⑦ 離心（14 000 r/min，5 min，4 ℃），取水相，加入等體積的酚氯仿異戊醇（25:24:1）。輕輕振搖，10 000 r/min 離心 10 min，重復兩次。

⑧ 取水相，加入 NaCl 使終濃度為 140 mol/L 和兩倍體積的預冷的無水乙醇混勾。

⑨ -20 ℃ 過夜。

⑩ 離心，用 70% 乙醇洗滌，晾干，加人含 RNA 酶的 TE 緩沖液重新密解。

（三）亞硫酸氫鈉修飾 DNA

① 取基因組 DNA 2 μg，用滅菌雙蒸水稀釋至 50 μl。

② 加入新鮮配制的 3 mol/L NaOH 5.5 μl（終濃度 0.3 mol/L），37 ℃ 水浴 10 min，使 DNA 變性為單鏈。

③ 依次加入新鮮配制的 10 mmol/L 氫醌（對苯二酚）30 μl 和 3 mol/L 亞硫酸氫鈉 520 μl，顛倒、輕柔混勻后，覆蓋 100 μl 石蠟油防止液體揮發，避光 50 ℃ 水浴 16 h。

（四）修飾后 DNA 的純化

① 預熱滅菌雙蒸水至 80 ℃。

② 使用 Promega DNA Clean Up（A7280）純化試劑盒純化 DNA，按照說明書操作。

③ 無菌水 50 pl 洗脫 DNA，12 000 r/ min 離心 1 min。

④ 加入 3 mol/L NaOH 5.5 μl（終濃度0.3 mol/L），室溫5 min，終止修飾。

⑤ 加入 10 mol/L乙酸銨 23 μl，中和，以 3 倍體積的冰無水乙醇，-20 ℃ 沉淀 4 h。

⑥ 離心（12 000 r/min，15 min，4 ℃），收集沉淀，晾干。

⑦ 無菌水重懸，-20 ℃ 凍存。

（五）PCR 反應體系和參數

反應體系（50 μl）：10 × PCR 緩沖液 5 μl，25 mmol/L 的 4 種 NTP 混合液 2.5 μl，正向引物（300 ng/μl）1 μl，反向引物（300 ng/μl）1 μl，DNA 模板 2 μl（少于 2 μg），dH2O 38.5 μl，Tag DNA 聚合酶 1.25 U。

反應參數：95 ℃ 預變性 5 min，加入 Taq DNA 聚合酶 1.25 U；95 ℃ 30 s，引物結合特異溫度 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；最后 72 ℃ 終延伸產物 4 min。

注意事項

1、MSP 的引物設計的質量是擴增成敗的關鍵性因素。

MSP 的引物設計與普通的 PCR 引物設計不同，MSP 的引物設計原理是：模板 DNA 在經過亞硫酸鹽處理后，發生甲基化的基因啟動子區域 CpG 島內 CpG 位點 5'-端胞嘧啶保持不變；而未發生甲基化的 CpG 島內 CpG 位點 5'-端胞嘧啶轉化為尿嘧啶，即 C-U。針對修飾前后的序列差異用 MethPrimer 軟件設計甲基化與未甲基化引物，進行 PCR 擴增。MSP 的引物序列中至少含有 1 個以上 CpG 位點，最好是含有多個 CpG 位點，這樣可保證引物的特異性，同時可以提高 DNA 啟動子甲基化堿基的檢出率。MSP 的引物必須按亞硫酸氫鈉處理后的 DNA 序列設計，同時也應該盡可能與普通 PCR 的引物設計原則相符合。按 MSP 的要求，任意 DNA 序列在做 MSP 擴增時，至少要合成 2 對引物，即甲基化引物與未甲基化引物。在 MSP 的未甲基化引物序列中正向引物不含鳥嘌呤堿基，反向引物不含胞嘧啶堿基。初設計 MSP 者最好用文獻引物進行研究。如果是為了篩選新的甲基化的抑癌基因而文獻中無法找到相應的 MSP 引物，可用在線 MethPrimer 軟件在線設計引物（網址為 http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html）。根據軟件提示可以找到所需要的 MSP 引物。但 MSP 所遇到的困難是，要擴增的是啟動子或部分第一外顯子序列，其（C+G）含量相對較高，MSP 擴增難度加大，因此設計好的引物最好用引物軟件如 Primer 5.0 從理論上推測其擴增效率，對于擴增效率小于 30% 的引物要進行優化，方法是在核心啟動子區域前后反復調整甲基化正向引物打增起始點，以期使引物擴增效率增高，降低擴增難度，從而提高 PCR 產量。

2、DNA 的亞硫酸氫鈉修飾

亞硫酸氫鈉修飾 DNA 的目的是將 DNA 序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉化為尿嘧啶，而甲基化的 5-甲基胞嘧啶保持不變。影響此過程的主要因素有修飾試劑的濃度、反應溫度、反應環境的 pH 值及反應時間。其中任何一個環節出現問題都將導致 MSP 擴增失敗，具體如下：

① 亞硫酸氫鈉的濃度最好控制在 3.0 ~ 3.9 mol/L，其 pH 值必須用 NaOH 精確調整至 5.0；

② 修飾時間應掌握在 10~16 h，修飾時間過長會導致甲基化胞嘧啶也會轉化成尿嘧啶且 DNA 模板破壞加劇，而時間過短會導致修飾不徹底；

③ 反應溫度應控制在 50~55 ℃（若用國產恒溫水浴箱建議溫度設定在 53 ℃ 為好）；

④ DNA 模板量應控制在 <2 μg 為宜。

3、MSP 的反應體系

MSP 的反應體系的成分與普通 PCR 一樣 ，反應體系的優化也與普通 PCR 類似，反應體系的優化與普通 PCR 的反應體系中最大的區別是 DNA 模板不同。經過修飾后的模板為單鏈狀態，MSP 的 DNA 模板在抽提后應檢測其純度和含量，其純度要求 A260/A280 在 1.8~2.0 之間；含量要準確檢測，否則在亞硫酸鹽處理時因 DNA 模板加得太多而導致 DNA 處理不完全致使 MSP 擴增失敗；而加的 DNA 模板太少則一方面浪費試劑，另一方面會因為目的片段太少導致 MSP 假陰性。Mg+ 濃度一般在 2.0~2.5 mmol/L 為宜，過低過高都不利于擴增。此外，PCR 的緩沖液及 Taq 酶的來源也很重要，一般的 PCR 緩沖液常常會導致結果不穩定，不同來源的 Taq 酶也會影響結果的重復性。我們建議用 Takara 公司針對富含 CG 等復雜二級結構模板的 TaKaRa LATaq 和 GC 緩沖液效果較好。而一旦選用某一廠家 Taq 酶后，不要輕易更換，以免 MSP 因重新優化而引起的時間和成本的浪費。

4、凝膠電泳分析

MSP 擴增結果時的 3 種情況：

① 產物電泳為陰性；

② 產物電泳出現多條非特異性條帶（含目的基因條帶）；

③ 產物電泳為陽性（僅目的基因條帶）。出現前 2 種情況時，可在保證反應體系和引物沒有問題的情況下，通過調整 MSP 的反應溫度而得到目的基因帶。方法如下：PCR 反應中，Tm 的高低與（C+G）含量呈正相關。因甲基化與未甲基化引物序列差異，在擴增過程中可能會出現 PCR 偏性。