外泌體提取純化（細胞上清）

材料與儀器

器材：高速離心機，渦旋振蕩器

試劑：Exosome Concentration Solution _120_mL，1 × PBS 緩沖液（無菌），Umibio 外泌體提取試劑盒（細胞上清液）

耗材：50 mL離心管，1.5 mL 離心管，Exosome Purification Filter * 20 Tubes

步驟

一、樣品預處理

1、取樣：如果是凍存樣品，從冰箱取出后于  25 ℃  水浴中進行解凍，將完全融化后的樣品置于冰上；如果是新鮮樣品，收集樣品后置于冰上；

2、樣品初始用量：單次提取時的樣品量建議細胞培養上清液不低于 20 mL；

3、離心去細胞顆粒：將樣品轉移至離心管中，于 4℃以3,000 ×g（~5,200 rpm）離心 10 min，去除樣品中的細胞碎片；（注：若沉淀較多，可3000 g，10 min離心多次至無明顯沉淀，每次取離心上清液。）

4、離心去雜質碎片：將離心上清液轉移至新的離心管中，于4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）離心10 min，去除樣品中的雜質碎片；

5、上清液轉移：去除雜質碎片的上清液轉移到新離心管中。

二、提取外泌體

1、上清液預處理：在去除雜質的離心上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 試劑），具體的加入劑量如下：（其他劑量請根據表中的試劑用量等比例換算）

樣品名稱 樣品劑量       加入 ECS 劑量 

細胞培養上清液 20 mL             5 mL 

2、溶液混合：加入 ECS 試劑后將離心管蓋緊，渦旋振蕩器混勻 1 min，再放置于 4℃ 靜置 8 h 以上；（注：增加靜置時間可提高外泌體得率，但靜置時間不可超過24h。）

3、沉淀外泌體：取出裝有混合液的離心管于 4℃ 以 10000 ×g （~9,500 rpm）離心 60 min，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；（注：盡可能吸凈上清液）

4、再次離心：將含有沉淀的離心管再次于 4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）離心2 min，棄上清（注：盡可能吸盡上清液）；

5、外泌體重懸：取合適量的 1×PBS 均勻吹打離心沉淀物，待其溶解后，將重懸液轉移至新的 1.5 mL 離心管中（建議每 20 mL 細胞培養上清用 200 μL 左右 1×PBS 重懸）；

6、收獲外泌體顆粒：將含有重懸液的 1.5 mL 離心管于 4℃ 以 12000 ×g （~12,400 rpm）離心 2 min，保留上清液，其中富含外泌體顆粒（注：若沉淀較多，可12,000 ×g，2 min 離心多次至無明顯沉淀，每次取上清液）。

 7 cm 有效離心半徑的小離心機換算（≤2 mL 離心管），下同。

三、純化外泌體

1、純化外泌體：將收獲的外泌體顆粒粗品轉入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以 3000 ×g （~6,200 rpm）離心 10  min，離心后收集 EPF 柱管底的液體，此液體即為純化后的外泌體顆粒（注：EPF 柱不可重復使用）；

2、外泌體的保存：純化后的外泌體以 50-100 μL 體積進行分裝保存于 -80℃ 低溫冰箱中，以備后繼實驗使用。