神經細胞原代培養實驗

原理

神經細胞的原代培養是盡 量 創造最適合于各類神經細胞生長的體外環境，獲得狀態良好，純度較高細胞的方法 。 腦部組織來源的各種神經細胞的培養具有相似的取材過程和部分通用的培養條件。

材料與儀器

動物組織
消化液(0.25%胰蛋白酶+O.04%的EDTA) 完全培養基(DMEM+10%胎牛血清＋雙抗） D-PBS液 多聚賴氨酸（包被濃度1OOμg ml) 滅菌超純水 殯伏 75%酒精
體視顯微鏡 相差顯微鏡 精細器械（彎鑷、直鑷、虹膜剪、75%酒精消毒） 眼科器械（彎鑷、直鑷、剪刀共3套 高壓消毒） 各種規格細胞培養瓶和皿（均來自Nunc公司） 彎頭滴管 1ml刻度滴管 15ml離心管 100mm玻璃皿 200目細胞篩網 低溫冰袋

步驟

除動物消毒以外，其他步驟都在超凈臺內進行 。

1. 動物的消毒：根據培養細胞的類型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神經細胞的培養。消毒方法分別如下 。

(1) 孕鼠操作 孕鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭從中心向外方向進行，可更換棉球 1- 2次，面積盡量大一些，包括整個腹部和外生殖器周圍 。 用第 1 套解剖器械打開動物腹腔，換第 2 套器械分離子宮并置于含冷 D -PBS 的 100mm 玻璃皿中，再換第 3 套器械在每只胎鼠的間隔處剪開子宮并剝離出胎鼠 。

(2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以內）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低溫消毒 10min 左右，動物失去知覺即可開始取材 。

2. 皮層組織的分離：新生鼠使用眼科剪將動物斷頭，并用鑷子剝除頭部的皮膚 。在冰 D -PBS 液中沿顱骨人字縫從后向前剝離 。 一般左手持彎鑷，在動物兩眼處以適當力度固定；右手持直鑷，完成剝除皮膚 、 骨骼以及分離組織等工作 。 在顯微鏡下利用精細器械分離皮層或海馬時，沿皮層邊緣以 45° 角小心劃開，并逐步使之剝離，轉移組織入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精細器械仔細去除每個皮層或海馬的腦膜（整個過程需要在低溫冰袋上完成） 。

3.組織的分散；用管口較粗的彎頭滴管吸去帶有腦膜的 D - PBS, 盡最去除干凈液體并避免吸走組織；用虹膜剪將組織逐撮均勻剪成乳糜狀，使組織塊為 lmm3 的大小為宜 。 加入合適體積的消化液（－般蓋過組織塊并且可以隨意搖晃即可），并均勻分散組織，放入37°C 孵育箱中消化約 15min (每間隔 3 -5min 用手輕輕搖晃1次，動物胎齡越小，越容易分散，消化時間可相應縮短） 。

4. 單細胞懸液的制備!用口徑較粗的彎頭滴管將消化好的組織吸入含 3 - 5ml 冰的完全培養基的 10ml 離心管中，靜置 5min 左右 。 用同樣的滴管將沉底的組織轉移到另 一個含約 5ml 冰的完全培養基的 10ml 離心管中，并開始吹打 。 吹打時每次不超過 15 次，先用粗口徑的彎頭滴管吹散，靜置片刻后將上清用細口徑彎頭滴管轉移至另 一個離心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的離心管中再加入完全培養基繼續吹打，并收集上清重復上述過程 。 反復吹打幾次后，組織塊基本消失，將全部上清過 200 目篩網以去除剩余組織塊并收集、計數 。 離心 (900r/min, 5min) 去除細胞碎片并將細胞重懸至合適的體積，以備后用 。

注意事項

1.在做原代之前準備工作一定要做好，提前配好液體。整個操作過程注意無菌，且培養液中如無特殊說明，均含有青－鏈霉素（雙抗）。

2.動物消毒應在遠離超凈工作臺的區域完成，成年動物尤其要注意。

3.組織取材過程全部在低溫環境中進行，可大大提高細胞存活；而且整個過程不宜太久，否則細胞活性明顯降低。

4.在組織分散過程中，一般3只左右動物來源的皮層在一個小皿中剪碎消化，不宜在同一個小皿中處理過多的組織。

5.吹打細胞用的彎頭滴管一定要事先經火焰拋光，否則細胞極易受傷而死亡；而且吹打細胞懸液時盡量避免產生過多氣泡，可以提高細胞的存活。

6.基本上原代培養的各種神經細胞都需要生長在經特殊物質處理過的培養介質上，比如多聚賴氨酸、層黏連蛋白等

常見問題

實驗心得：

1.大鼠和小鼠來源的神經細胞培養方法大致上相同，除特殊提到以外，基本可以通用。

2.去除腦膜時，一般左手持懾輕柔固定組織，右手負責剝離。整塊腦膜一同被剝離后，往往細胞培養物中的成纖維細胞污染較少。

3.胰酶消化液處理后的組織往往發黏，這是細胞釋放出DNA的原因。這并不會影響消化效果，而且可以在后面的吹打過程中去除。對于初學者，可以通過在消化液中加入DNA酶的方法提高最終細胞的產量。

4.在胰酶消化液中加入EDTA有利于組織細胞團分散成單細胞，終止EDTA的作用主要依靠稀釋以降低其濃度。

來源：《神經生物學實用實驗技術》第四軍醫大學出版社