pH 值、溫度、抑制劑對蔗糖酶活性的影響
原理
酶的活性和穩(wěn)定性易受環(huán)境pH 的影響。通常各種酶只在一定的pH 范圍內(nèi)才表現(xiàn)出活性，各種酶在特定條件下都有它各自的最適pH。
溫度對酶的作用具有雙重影響，在較低的溫度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速度隨溫度升高而增大，但是超過一定溫度后，反應(yīng)速度反而下降。
抑制劑與酶的活性部位結(jié)合，改變了酶活性部位的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)，引起酶活力下降。抑制劑與酶結(jié)合分為可逆與不可逆抑制劑。可逆抑制劑與酶是通過共價鍵結(jié)合，不能用透析等物理方法解除。
材料與儀器
蔗糖
磷酸氫二鈉 磷酸二氫鈉 檸檬酸 乙酸鈉 脲 乙酸緩沖液 葡萄糖 二硝基水楊酸
分光光度計 水浴鍋 試管 保鮮膜
實驗方法 1:
1. 按下表配制12 種緩沖溶液(公用)。
將兩種緩沖試劑混合后總體積均為10 ml，其溶液pH 值以酸度計測量值為準(zhǔn)。
2. 準(zhǔn)備二組各12 支試管， 第一組12 支試管每支都加入0.2 ml下表中相應(yīng)的緩沖液， 然后加入一定量的蔗糖酶（此時的蔗糖酶只能用H2O 稀釋， 酶的稀釋倍數(shù)和加入量要選擇適當(dāng)，以便在當(dāng)時的實驗條件下能得到0.6～1.0 的光吸收值（A650） ）。另一組12 支試管也是每支都加入0.2 ml下表中相應(yīng)的緩沖液，但不再加酶而加入等量的去離子水，分別作為測定時的空白對照管。所有的試管都用水補足到0.8 ml。
3. 所有的試管按一定時間間隔加入0.2 ml 蔗糖（0.2 mol/L）開始反應(yīng)， 反應(yīng)5 min后分別加入1.0 ml 0.2 mol/L NaOH 終止反應(yīng)， 接著加入1 ml 二硝基水楊酸試劑， 用保鮮膜包住試管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5 min，取出速冷，然后加入5.0 ml 水，搖勻測定A520。
4. 本實驗再準(zhǔn)備二支試管， 一支用水作空白對照; 另一支作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管。
5. 畫出不同pH 下蔗糖酶活性（μmol/ min）與pH 的關(guān)系曲線，注意畫出pH 值相同， 而離子不同的兩點， 觀察不同離子對酶活性的影響。
實驗方法2:
本實驗要測定0～100 ℃之間不同溫度下蔗糖酶催化和酸催化的反應(yīng)速度。包括冰水浴的0 ℃、室溫(約20 ℃)、沸水浴的100 ℃和不同的水浴溫度:10 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃。
每個溫度準(zhǔn)備2支試管，一支加酶，測酶催化，1支不加，以乙酸緩沖液作為酸，測酸催化。
1. 確定酶的稀釋倍數(shù)，試管中加入0.2 ml 0.2 mol/L，pH 4.9的乙酸緩沖液，0.2 ml稀釋的酶，加水至0.8 ml，加入0.2 ml 0.2 mol/L的蔗糖開始計時，在室溫下反應(yīng)5 min分別加 入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH 終止反應(yīng)，接著加入1 ml二硝基水楊酸試劑，用保鮮膜包住試管口并刺一小孔，在沸水浴中煮5 min，取出速冷，然后加入5.0 ml水，搖勻測定A520。
2. 測定上列各個溫度下的反應(yīng)速度，每次用2支試管，均加入0.2 ml乙酸緩沖液，一支加0.2 ml酶，另一支不加酶，均用水調(diào)至0.8 ml，放入水浴溫度下使反應(yīng)物平衡30 s，加入0.2 mol/L蔗糖0.2 ml，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，立即加入1.0 ml 0.2 mol/LNaOH終止反應(yīng)，按規(guī)定進行操作，測定各管A520值，記錄每個水浴的準(zhǔn)確溫度。
3.酶催化的各管A520值均進行酸催化的校正。分別畫出酶催化和酸催化的反應(yīng)速度對溫度的關(guān)系曲線和lnk-1/T的關(guān)系曲線，用二條lnk-1/T關(guān)系曲線的線性部分計算兩種活化能。
實驗方法 3 :
1. 判斷可逆與不可逆抑制的實驗可選做。
2. 不含抑制劑(脲)的實驗，可用實驗(七)的數(shù)據(jù)，但必須用同一稀釋倍數(shù)的酶，也可以重做，注意酶濃度要大些。
3. 含脲抑制劑的實驗可參照表2設(shè)計實驗方案。共做三種抑制劑濃度[I]的實驗，即分別為加4 mol/L的脲0.10 ml、0.20 ml和0.30 ml（注意:此時要分別少加H2O 0.1 ml、0.2 ml和0.3 ml），仍為12支試管，每支試管都要加脲，第9、第10兩管仍為校正酸水解。第11、第12標(biāo)準(zhǔn)管也要加脲，以消除脲對顯色的影響。
4. 畫出反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系圖，和I/V-I/[S]關(guān)系圖，計算Km、Vmax、KI和相應(yīng)的表觀值，討論脲對蔗糖酶活性的影響。
