離子交換法制備肝素實(shí)驗(yàn)

原理

測(cè)定肝素的方法主要有生物測(cè)定法、紫外分光光度法、化學(xué)法。肝素分子具有強(qiáng)負(fù)電性，能與帶正電荷的分子結(jié)合生成復(fù)合物。天青A是一種堿性染料，和肝素生成的復(fù)合物表現(xiàn)出“光異色現(xiàn)象”，即改變?nèi)玖显械奈展庾V。控制染料濃度，在pH 8.6介質(zhì)中肝素濃度低時(shí)，505 nm的光吸收與肝素濃度的關(guān)系符合朗-比爾定律。

材料與儀器

腸粘膜或豬肝
巴比妥緩沖液阿拉伯膠天青A 肝素
燒杯試管試管架玻棒磁力攪拌器電爐吸濾瓶布氏漏斗離心機(jī) 722分光光度計(jì) 容量瓶真空干燥器真空泵水浴鍋濾紙布袋。精密pH試紙

步驟

溶液配制：
1. 巴比妥緩沖液(pH 8.6，0.05 mol/L)：稱取1 g氫氧化鈉溶于50 ml沸水，再精確稱取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中，冷卻后稀釋至500 ml，pH計(jì)校正到pH8.6。
2. 0.1%阿拉伯膠溶液：稱取0.5 g，先用少量水分散，再稀釋至500 ml，過(guò)濾備用。
3. 0.1%天青A溶液(稱取0.5 g，先用少量水在研缽中研磨溶解，再稀釋至500 ml，過(guò)濾，冰箱儲(chǔ)備。用時(shí)再稀釋5倍。
4. 肝素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取一定量的肝素標(biāo)準(zhǔn)品，用滅菌水配成100 U/ ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，冰箱暫放，用時(shí)以水稀釋100倍。

操作步驟：
1.提取（鹽解法）
新鮮豬腸粘膜2 kg（或豬肝搗碎），加入氯化鈉80 g（4%濃度），攪拌溶解后用40%氫氧化鈉溶液調(diào)p H至9.0（用廣泛pH試紙），水浴加熱至50～55 ℃攪拌提取2 h，然后升溫至90℃保持10 min，冷卻至60 ℃用布袋過(guò)濾，取濾液待離子交換用。

2.離子交換
將濾液用水稀釋3倍，加入D254樹(shù)脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速攪拌6 h（可每隔1 h抽樣測(cè)定提取液中剩余肝素的含量），過(guò)濾取樹(shù)脂。

3.洗滌、洗脫
取離子交換后的樹(shù)脂先用自來(lái)水洗凈，而后用蒸餾水洗凈。取洗凈樹(shù)脂加入等體積1.4 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌1 h，過(guò)濾取樹(shù)脂。繼續(xù)用0.5倍體積的5 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h，過(guò)濾收集濾液（取樣測(cè)含量）。樹(shù)脂再加入0.5倍體積的3 mol/L氯化鈉溶液，慢速攪拌1 h，過(guò)濾，濾液收集（取樣測(cè)含量）。樹(shù)脂再用0.5倍3 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h，過(guò)濾，濾液收集（取樣測(cè)含量），合并三次洗脫濾液。

4.粗制肝素
取合并濾液加入1.5～2倍體積的95%乙醇洗一次，丙酮洗兩次，真空干燥即得粗品肝素。

5.精制肝素
稱取粗制肝素粉末用1%氯化鈉溶液（預(yù)冷卻）適量溶解，調(diào)pH1.8左右，離心15 min，上清液經(jīng)砂心漏斗去除離心液表面的脂肪。懸液在水浴上加熱至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高錳酸鉀溶液（按0.1～0.2 mol/億單位），用濾紙法檢測(cè)終點(diǎn)，濾液加入30%過(guò)氧化氫，調(diào)p H至11，放置36 h（冰箱內(nèi)）。抽濾，濾液調(diào)pH至6.4，加入1倍體積的95%乙醇，離心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗兩次，真空干燥即得精制肝素。

6.天青法測(cè)定效價(jià)
（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:取較大試管（易混勻）6支，以0～5編號(hào)，按下表操作。加入阿拉伯膠后必須搖勻方可加入染料，混勻后用722型分光光度計(jì)測(cè)505 nm處吸收值，以吸收值為縱坐標(biāo)，單位數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2）樣品測(cè)定:精確稱取樣品約10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2個(gè)100 ml容量瓶稀釋為1 mg/100 ml溶液、2 mg/100 ml測(cè)定液，按下表操作并記錄吸收值，分別從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)單位數(shù)，按下式計(jì)算樣品效價(jià)，取平均值。

單位為U/ mg ，式中Pi 為由A 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的單位數(shù)；V 為測(cè)定樣品的總毫升數(shù)；Vi 為測(cè)定所用樣品的毫升數(shù)；Sw 為稱取樣品的毫克數(shù)。