谷丙轉氨酶的活性測定實驗

原理

血清谷丙轉氨酶（SGPT）能催化丙氨酸與酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼可縮合成丙酮酸二硝基苯腙，該腙在堿性條件下呈現出橙紅色，呈色深淺符合比爾定律，在520 nm處有最大吸收。SGPT 在肝臟中含量最高，由于肝細胞損害，該酶逸出血液，可使 SGPT 含量明顯增高。因此測定血清谷丙轉氨酶的活性可作為肝中毒肝病的重要指標。

材料與儀器

丙酮酸
丙酮 α-酮戊二酸 dl-丙氨酸 2 4-二硝基苯肼 氫氧化鈉
恒溫水浴鍋 722S分光光度計 吸量管 試管 試管架

步驟

溶液配制：
1. 丙酮酸標準溶液：準確稱取22 mg純凈丙酮酸鈉，用pH 7.4磷酸緩沖液定容至100 ml。
2. SGPT底物溶液：準確稱取α-酮戊二酸87.6 mg，dl-丙氨酸5.34g，先用90 ml 0.1  mol/L pH7.4的磷酸緩沖液溶解，然后用20%NaOH溶液調至pH7.4，再以上述磷酸緩沖液稀釋至300 ml，冰箱保存可用一周（加氯仿防腐）。
3. 0.1 mol/L pH7.4的磷酸緩沖液。
4. 2，4-二硝基苯肼溶液：稱取19.8 mg2，4-二硝基苯肼，置于100 ml容量瓶中，先用8 ml濃鹽酸溶解后，再加水稀釋至刻度。
5. 0.4  mol/L氫氧化鈉溶液。

操作步驟：
1. 標準曲線的繪制：取干燥潔凈試管6支，編號，按下表所示添加試劑。
 
 
向每管加0.5 ml2，4-二硝基苯肼，再保溫20 min，分別向各管加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，室溫下靜置10 min后，用蒸餾水調零點，于520 nm處測光密度。以各管光密度減去空白管光密度為縱坐標，丙酮酸微克數為橫坐標作標準曲線。
 
2. SGPT活力測定：取潔凈干燥試管4支，即測定管、對照管各2支，按下表添加試劑。
各管反應完畢，混勻，室溫下靜置10 min后，再以蒸餾水調零點測定光密度。由標準曲線上查得丙酮酸微克數，根據下式計算SGPT 的活力：SGPT 活力（單位）=（測定管微克數-對照管微克數）/2.5×0.1。

注意事項

1. 在呈色反應中，2，4-二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙，底物中α-酮戊二酸可與之發生反應，生成α-酮戊二酸苯腙。故制作標準曲線時，需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影響。
2.在測定 SGPT 活力時，應事先將底物、血清在37 ℃水浴中恒溫，然后在血清管中加入底物，準時計時。
3.標準曲線上數值在20～100 U是準確可靠的，超過200 U 時，需將樣品稀釋。
4.丙氨酸應使用 DL-型，不使用 D-型。如使用 L-型，用量減半。
5.溶血標本不宜使用，因血細胞內轉氨酶活力較高，會影響測定結果。