mRNA 的分離實驗

原理

哺乳動物細胞的絕大部分mRNA在其3‘ 端均有一poly（A）尾，因此可以用oligo（dT）-纖維素親和層析法從大量的細胞RNA中分離mRNA。

材料與儀器

步驟

1.  用0.1 mol/L NaOH懸浮0.5～1.0 goligo（dT）-纖維素。
 
2.  將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有用DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5～1.0 ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1 ml的oligo（dT）-纖維素最大量為10 mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應減少oligo（dT）-纖維素的使用量，以防止poly（A）+RNA在過柱以及后續步驟中損失。
 
3.  用無菌的1×層析柱加樣緩沖液沖洗柱床，直至流出液的 pH 值小于8.0。1×層析柱加樣緩沖液為：20 mmol/L Tris-  HCl（pH7.6），0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1%SDS。
 
可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液：將適量無RNA酶的Tris-HCl（pH7.6）、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15 lbf/in2（1.034×105 Pa）高壓下蒸汽滅菌，待其冷卻至65 ℃左右時加入已在65 ℃預熱30 min的10%SDS貯存液。也可以用0.05 mol/L檸檬酸鈉代替Tris- HCl，然后用DEPC處理檸檬酸鈉-NaCl-EDTA和SDS的混合溶液。
 
4.  用滅菌水溶解RNA，于65 ℃溫育5 min后迅速冷卻至室溫，加等體積的2×層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。當所有的RNA溶液均進入柱床后，加1倍體積的1×層析柱加樣緩沖液，繼續收集洗出液。加熱RNA可以破壞poly（A）尾的二級結構。
 
5.  當全部溶液流出后，將收集液置于65 ℃溫育5 min，重新上樣，并收集流出液。
 
6.  用5～10倍柱床體積的1×層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測定每一收集管的OD 260。最后由于不帶poly（A）的RNA洗過柱床，OD260會很高，后來OD260值則很小或為零。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱體積的含0.1 mol/L NaCl的1×層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly（A）的RNA很少甚至沒有，因此這一步驟可以省略。
 
7.  用2～3倍柱床體積的經滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3～1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.05%SDS。
 
用于配制洗脫緩沖液的Tris-HCl和EDTA貯存液應為新近高壓處理的溶液，可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓處理會使溶液產生大量氣泡。
 
8.  收集液置于透明的小容器內，測定OD260，使用前比色杯須用濃鹽酸-甲醇（1∶1）浸泡1 h，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗，合并含有RNA的洗脫組分。經上述一輪oligo（dT）-纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly（A）RNA，其含量近乎相等。如欲進一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3 min，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5 mol/L，用同一oligo（dT）-纖維素柱進行第二輪層析。
 
9.  收集oligo（dT）-纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3  mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3 mol/L，混勻。加2.5倍體積用冰預冷的乙醇，混勻，冰浴至少30 min。
 
10.  于4 ℃以10000×g離心15 min，回收poly（A）+RNA，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀（通常看不見沉淀），離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。
 
11.  用少量水重溶RNA，置于比色杯內，測定OD260，使用前比色杯須用濃鹽酸-甲醇（1∶1）浸泡1   h，再用經DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗。
 
12.  將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內，加3倍體積乙醇，混勻，于-70 ℃保存備用。回收RNA時，只需取出一小份貯存液，加3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3 mol/L，混勻，用微量離心機于4 ℃以12000×g離心5 min即可。

注意事項

1.  OD260=1的溶液其RNA含量約為40 μg/ml。
2.  從107個哺乳動物培養細胞中可獲得1～5 μgmRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1%～2%。
3.  現可直接從公司購買純化試劑盒。