背根神經(jīng)節(jié)細胞的原代培養(yǎng)實驗
原理
原代培養(yǎng)是指由體內(nèi)取出組織或細胞進行的首次培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)離體時間短，遺傳性狀和體內(nèi)細胞相似，適于做細胞形態(tài)、功能和分化等研究。較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質(zhì)，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。
材料與儀器
孵化8-12d的雞胚。孕15d及新生1-3d的大、小鼠仔鼠
含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 神經(jīng)元維持培養(yǎng)基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺+20ng mlNGF) 10μM阿糖胞苷(ARA-C)
培養(yǎng)瓶
步驟
獲得消毒動物后詳細的步驟如下：
1．無菌條件下仰臥放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，斷頭后打開胸腹腔，除去內(nèi)臟器官。從頸部椎管開口插入顯微剪，沿脊柱背側(cè)中線兩側(cè)剪開椎管，去除暴露脊髓后，即在椎間孔旁可見到沿脊柱兩側(cè)排列的背根節(jié)，用精細顯微攝小心提取，并剝除其被膜。
2.若施行組織塊培養(yǎng)，可用精細顯微剪將每個背根節(jié)剖為2-3個植塊，直接接種于涂有鼠尾膠的基質(zhì)上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。
3.如若需要背根神經(jīng)節(jié)分散細胞培養(yǎng)，則可將分離好的DRG組織塊收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。而后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為(0.5-1)X105/ml接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質(zhì)上，37℃,5%CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
4.以上兩種培養(yǎng)方法24h后均傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用無血清培養(yǎng)液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培養(yǎng)。接種第3天，加入細胞分裂抑制劑ARA-C以抑制非神經(jīng)細胞的增殖，作用48h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周1/2量換液2次。
5.純化培養(yǎng)的DRGs可以存活2個月之久，純度可達96%以上。分散培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元48h可見胞體有光暈感，圓形或橢圓形，大小不一，有多極、雙極和假單極神經(jīng)元。2d后給予抑制劑處理后，DRG突起生長迅速，形成稀疏網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長并增粗，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加致密，雜質(zhì)細胞已經(jīng)脫壁漂浮，培養(yǎng)物背景變得干凈清晰很多，免疫細胞化學(xué)進一步鑒定培養(yǎng)細胞為神經(jīng)絲(NF)陽性（圖1-3)。
注意事項
1.組織塊培養(yǎng)中，由千背根節(jié)被膜的剔除較為困難，將每個背根節(jié)剖為2-3個植塊則更有利于細胞從植塊中爬出，明顯提高植塊的存活率。
2.獲取組織的消化培養(yǎng)時間要視動物年齡做相應(yīng)的調(diào)整，即胚胎期可以控制在20-30min,而仔鼠可以在30-50min內(nèi)。
3.隨著無血清培養(yǎng)基的推廣，最新文獻報道也將其運用千DRG的培養(yǎng)。但有所不同的是無血清培養(yǎng)基可以直接用于接種海馬、皮層等中樞神經(jīng)元，而DRG則需含血清培養(yǎng)基先接種培養(yǎng)24h后，再換無血清培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)，這一點至關(guān)重要，否則DRG不能成活。
4.細胞純化培養(yǎng)時，注意把握ARA-C加入的時間點。若細胞密度較高，無血清培養(yǎng)1d后即可加入，而出細胞密度較低時則需2d后再加入。另外逐步1/2量換去含ARA-C的無血清培養(yǎng)液是保證DRG神經(jīng)元高純度的關(guān)鍵步驟。
常見問題
1.解剖方法上，在DRG分離過程中，腹側(cè)解剖暴露脊髓至關(guān)重要。筆者嘗試從背側(cè)解剖路徑取材不容易獲得完整的DRG組織，從而影響細胞的獲得率。
2.筆者選用鼠尾膠原作為培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞體及軸突的貼壁能力更強更穩(wěn)定，適于長期觀察；而生長在多聚賴氨酸基質(zhì)層上的神經(jīng)元只能在短期內(nèi)貼壁穩(wěn)定，隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)元的突起則會漂浮起來，失去基質(zhì)的支持。特別是經(jīng)過純化后的DRG在短期內(nèi)就會連同整個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)脫壁。
3.小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生長分化基本上與大鼠相似，但小鼠背根節(jié)神經(jīng)元的胞體較大鼠稍小。雞胚背根節(jié)神經(jīng)元以假單極為多見，神經(jīng)突起分枝較少。
4.植塊培養(yǎng)時，應(yīng)先加少撮培養(yǎng)液覆蓋每個植塊即可，否則植塊會被液體浮起，失去基質(zhì)的支持而無法生長。
來源：《神經(jīng)生物學(xué)實用實驗技術(shù)》第四軍醫(yī)大學(xué)出版社
