IrECM三維培養(yǎng)乳腺干細(xì)胞

材料與儀器

乳腺干細(xì)胞
D920細(xì)胞或等同物 H14培養(yǎng)基 DMEM 0.5FB EDTA:DMEM 含有0.5% FBS和0.1mmol EDTA 不含血清的DMEM Matrigel
抗鼠igG磁珠 MACS柱 含冰的冰盒

步驟

(a)在I型膠原包被的培養(yǎng)瓶中用H14培養(yǎng)基培養(yǎng)D920細(xì)胞至70%?80%匯合。

(b)消化細(xì)胞，用DMEM/0.5FB/EDTA重懸至l×107個(gè)細(xì)胞/ml。

(c)加人1:50稀釋的抗ESA抗體，置冰上孵育30 min。

(d)用10ml無(wú)血清的DMEM洗滌一遍，然后用DMEM/0.5FB/EDTA重懸至1×107個(gè)細(xì)胞/ml。

(e)按照制造商推薦的濃度，加人抗鼠IgG磁珠，置冰上孵育30 min。

(f)用10 ml無(wú)血清的DMEM洗滌一遍，然后用DMEM/0.5FB/EDTA重懸至1×107個(gè)細(xì)胞/ml。

(g)將細(xì)胞懸液加人到合適體積的MACS柱中。

(h)用3倍細(xì)胞懸液體積的DMEN/0.5FB/EDTA培養(yǎng)基洗滌MACS柱。

(i)從磁鐵上取下柱子，用H14培養(yǎng)基洗脫。

(j)將基底膜基質(zhì)（Matrigel)置于冰上，在24孔板中每孔加人5μL包被。

(k)置37℃，10 min使之聚合。

⑴與此同時(shí)，用300μ1冰浴的Matrigel重懸1×103?1×104的D920細(xì)胞。

(m)加人到包被的24孔板中，置37℃,10 min使之聚合。

(n)加入H14培養(yǎng)基，每2天換液。