胚胎鼠成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)

簡介

細(xì)胞培養(yǎng)是模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體內(nèi)取出，在人工條件下培養(yǎng)，使細(xì)胞生存、生長、繁殖和傳代，從而可以進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變等問題的研究。

原理

細(xì)胞培養(yǎng)是指將細(xì)胞從動(dòng)物或植物體內(nèi)取出，然后在適宜的人工環(huán)境中生長的過程。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機(jī)械方法進(jìn)行解離，也可以來源于已建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株。包括原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。

原代鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞培養(yǎng)是指從孕鼠中剖取適宜胎齡的胎鼠，采用酶消化法或或組織塊貼壁法獲得原代胚胎成纖維細(xì)胞。

用途

1、用于支持干細(xì)胞的培養(yǎng)；

2、進(jìn)行體外研究；

材料與儀器

【材料】：

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶（含EDTA）、青霉素-鏈霉素（雙抗）、無菌PBS溶液、懷孕14-15天的母鼠、60mm無菌培養(yǎng)皿、100mm無菌培養(yǎng)皿、無菌離心管；

【主要儀器】：

倒置顯微鏡、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、4℃離心機(jī)、高壓滅菌的手術(shù)器械（包括眼科剪、眼科鑷等）。

步驟

1、取懷孕14-15的小鼠,采用脫頸椎的方法將小鼠處死,將小鼠浸泡在酒精中2-3nin；

2、暴露孕鼠腹部皮膚，用眼科剪將剪開腹壁以暴露出子宮角，取出子宮，將其子宮置于裝有PBS（含雙抗）的的培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS沖洗3次（冰上操作）；

3、將取出的子宮轉(zhuǎn)移至新的無菌培養(yǎng)皿中(裝有預(yù)冷的PBS),用眼科剪沿子宮系膜打開子宮，取出帶有胎膜的胎鼠，并用兩把眼科鑷子剔除胎膜，取出胎鼠(冰上操作）；

4、將胎鼠移入新的含預(yù)冷的PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科剪和眼科鑷去除胎鼠的頭部、四肢和內(nèi)臟，得鼠胚軀干(冰上操作）；

5、 將鼠胚軀干轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷PBS的新的無菌培養(yǎng)皿中，用含雙抗PBS洗滌至無肉眼可見的血色(冰上操作）；

6、將上一步獲得組織移入另一含預(yù)冷DMEM]的培養(yǎng)皿中，剪碎至肉糜狀，加入0.25%胰酶，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱消化15-20min；

7、15-20min后加入含血清的DEME培養(yǎng)基終止消化；

8、將200目篩網(wǎng)置于50ml離心上,將細(xì)胞懸液滴至篩網(wǎng)上過濾；

9、將獲取濾液轉(zhuǎn)移至15m離心管中,1000r，4℃離心5min；

10、棄上清，重新加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液；

11、將懸液接種到預(yù)先用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中或培養(yǎng)皿，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育；

12、4-6小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況，更換新鮮培養(yǎng)液；

注意事項(xiàng)

1、剖取組織要在冰上操作；

2、沖洗組織時(shí)，用含雙抗的PBS洗滌；

3、成纖維細(xì)胞易于貼壁，4小時(shí)就可以獲得貼壁成纖維細(xì)胞；

常見問題

1、細(xì)胞污染：注意操作過程嚴(yán)格無菌，子宮、胚胎沖洗時(shí)用含雙抗的PBS；

2、獲取細(xì)胞碎片較多：注意消化時(shí)間控制，切勿過度消化；

3、過200目細(xì)胞篩網(wǎng)時(shí)，懸液難以過濾：組織盡量減至肉糜狀、胰酶使用前在37℃水浴鍋充分預(yù)熱；