內溶素活性檢測

簡介

作為噬菌體衍生的酶，內溶素本質是一種蛋白分子，其通過分解細菌細胞壁的肽聚糖成分，幫助噬菌體顆粒從細菌宿主釋放，可在噬菌體復制過程中表達，破壞細菌細胞壁肽聚糖的關鍵化學鍵。

原理

利用內溶素對宿主菌的裂解效果檢測能夠反映其抗菌活性，將內溶素與宿主菌共孵育后，通過濁度測定統計加入內溶素前后的 OD600 的變化，利用細菌計數法測定活菌數，并在光鏡與透鏡下觀察加入內溶素前后宿主菌的形態差異來檢測抗菌活性。

用途

為治療抗生素耐藥的細菌感染提供潛在解決方案。

材料與儀器

儀器：

離心機、多功能酶標儀、光學顯微鏡

透射電鏡

試劑：

宿主菌（Kp3、CRKP 等，可多選幾種）

LB 培養基、PBS 緩沖液

反應緩沖液（0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl，pH 7.4）

3% 磷鎢酸鉀

步驟

1、OD600 測定分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養基中培養 3 h，至 OD 值達到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，注入 96 孔板中進行分析，每孔注入 180 μL，實驗組中加入 20 μL 終濃度為 2 mg/mL 的純化內溶素蛋白，陰性對照組加入反應緩沖液，通過多功能酶標儀檢測。

2、細菌計數法測定分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養基中培養 3 h，至 OD 值達到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，取出 10 μL 樣本作為零時刻陰性對照組，再向原有菌液加入終濃度為 2 mg/mL 的純化內溶素蛋白，37 ℃ 孵育 30 min 后取出 10 μL 作為實驗組，采取 10 倍稀釋法對各組樣品涂布平板計數，重復三次取平均值。

3、光鏡分析：

挑取宿主菌單菌落接種于 LB 培養基中過夜，次日以 1:100 的比例接種至新的 LB 培養基中培養 3 h，至 OD 值達到 0.8~1.0 之間。

取 1.5 mL 的菌液 16000 g 離心 2 min，PBS 洗滌 2 次后重懸于 500 μL Tris-HCl 緩沖液（含 1% TritonX-100）中，實驗組中加入 20 μL 終濃度為 2 mg/mL 的純化內溶素蛋白，陰性對照組加入反應緩沖液，每組取 50 μL 樣品經亞加藍染色后于光鏡下觀察。

4、透射電鏡分析：

樣品制作同光鏡樣品，每組取 50 μL 樣品滴到有膜的銅網上，靜置數分鐘后，用濾紙吸取多余的液體，滴上 3% 磷鎢酸鉀對樣品進行負染色，待干后電鏡下觀察。