抗體的生物素化標記

原理

抗體生物素標記是指將標記物（生物素）共價偶聯到抗體上，標記后的抗體蛋白與待檢測物（如免疫蛋白）特異性反應形成多元復合物，并借助于酶標檢測儀、流式細胞儀等精密儀器對試驗結果進行自動化測定，從而對待測物進行定性和定量測定。

材料與儀器

待標記抗體、生物素 （Thermo）、純水

EP 管、移液槍、1X PBS溶液 PH 7.2~7.4

透析袋、BCA 試劑盒、96 孔板、37 ℃ 恒溫箱

搖床

步驟

1、生物素標記抗體

（1）根據 Thermo 的說明書，將所用試劑及待標記抗體恢復至室溫，稱取一定量的生物素，使用無菌水溶解并稀釋生物素至終濃度為 5.5 mg/mL。

（例：每 1.0 mg 生物素用 180 μL 的無菌純水溶解成 5.5 mg/mL 的溶劑。）

（2）生物素與抗體質量比例為 5~20:1，將計算好的對應質量的生物素及待測抗體混合，總體積要大于 100 μL。

（3）室溫下避光旋轉反應1 h。

（4）反應結束后，用 1×PBS 溶液 4 ℃ 搖床透析過夜。次日，換新的 1×PBS 溶液繼續透析 5 h。

（5）透析結束后，收集并分裝，-80 °C 避光保存，長期保存可添加終比例為 60% 的甘油。

2、標記后抗體濃度檢測

（1）利用 BCA 法測定標記后抗體濃度。用標準品稀釋液將標準蛋白（0.5 mg/mL BSA）按所需梯度稀釋加入到 96 孔板中，總體積為 20 μL。

（2）將待測抗體稀釋 10 倍，加入 20 μl 稀釋液至 96 孔板中（做復孔）。

（3）將 BCA 試劑盒中的 Solution A 搖晃混勻，根據樣品數量，按 50 體積 Solution A 加 1 體積 Solution B（50:1）配制適量 BCA 工作液，充分混勻。

（4）各孔加入 200 μL BCA 工作液，用加樣槍輕輕吹打混勻，37 ℃ 恒溫箱放置 30 min。

（5）冷卻至室溫后，用酶標儀測定 A562。

（6）根據結果繪制標準曲線并計算出樣品中蛋白濃度。

注意事項

1. 待標記物的蛋白濃度不能過低，如若濃度過低需經超濾濃縮等手段提高濃度至 0.1 mg/mL 以上。

2. 如果偶聯基團為氨基，待標記物的系統不得含有游離的氨基（Tris, 氨基酸）、載體蛋白（BSA）或者其他干擾物，若有干擾物需要用標記緩沖液反復超濾確保其去除干凈，若采用其他基團偶聯試劑，待標記物系統亦不能有含對應的游離基團的物質。

3. 如果待標記物為分子量較小的物質，在純化過程中注意超濾管、脫鹽柱、透析袋的截留分子量。

4. 標記反應后的體積量至少在 100 μL 以上，以達到純化時的最小上樣量。

5. 標記反應完成后（氨基偶聯體系），可在體系中加入適量的含游離含氨基小分子物質，中和游離的生物素活化試劑，提高純化效率，減少后續反應的假陽性和高背景。

6. 純化后的標記蛋白可采用 A280 或 BCA 法測定蛋白濃度。

7. 標記純化后的蛋白可根據蛋白性質進行分裝長期保存，減少凍融次數。