干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

簡(jiǎn)介

人子宮內(nèi)膜是一個(gè)高度再生的組織，這種巨大的再生能力被認(rèn)為與人類子宮內(nèi)膜干細(xì)胞有直接關(guān)系。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分類較為多樣化，包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞側(cè)群（side population，SP）、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞、月經(jīng)血來(lái)源的干細(xì)胞等。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（enMSCs）是一類具有自我更新能力、分化潛力、低免疫原性、低致瘤性等生物學(xué)特性的新型成體干細(xì)胞。

用途

分離的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞可以臨床治療月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜疾病、不孕癥、器官損傷。

材料與儀器

DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基、胎牛血清

D-Hanks緩沖液、膠原酶III、DNase I

青鏈霉素

CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CD133 抗體

2.5% 胰蛋白酶

步驟

一、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1、手術(shù)切取子宮內(nèi)膜全層和子宮肌層（5 mm）迅速放入裝有 0 ℃ D-Hanks 的無(wú)菌瓶中。

2、在超凈臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌 D-Hanks（含青鏈霉素）洗滌 2 次，去除表面血液等雜物。

3、充分洗干凈后，用眼科剪將其剪碎至大小約 1 mm3 左右。之后迅速將組織置入裝有 300 mg/mL 膠原酶III 和 40 mg/mL DNase I 的 15 mL 離心管中，在此過(guò)程中保持組織始終浸泡于消化酶中。

4、37 ℃ 震蕩消化 45 min，在此過(guò)程中間斷利用移液器向離心管底部輕輕吹打氣泡（以保持連續(xù)冒出氣泡為宜）。

5、小心吸取消化液，保留組織碎塊，消化液經(jīng) 200 目的濾網(wǎng)過(guò)濾，消化好的單個(gè)細(xì)胞形成濾液。

6、1000 r/min 離心步驟（5）中所得的消化液 10 min，棄去上清。

7、0 ℃ D-Hanks 洗滌細(xì)胞 2 次。

8、加入 DMEM-F12 培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清），在 37 ℃，含 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

9、首次換液時(shí)間為培養(yǎng)的 4~5 d，可去除大部分未貼壁細(xì)胞及殘留的紅細(xì)胞，并觀察細(xì)胞的形態(tài)、排列方式，拍照。期間 2~3 d 換液 1 次，待細(xì)胞融合達(dá)到 80% 左右時(shí)，按 1:1~1:2 比例用 2.5% 胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代。

10、經(jīng) 2~3 代的傳代培養(yǎng)純化，分離得到純度較高的人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞。第 3~6 代的細(xì)胞可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1、選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞集落，離心收集細(xì)胞，棄上清，用 D.Hanks 液洗滌細(xì)胞兩次，制成濃度為 1×106 L-1 單細(xì)胞懸液，分別加入 10 μL 的 CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CD133 抗體，4 ℃ 避光孵育 30 min。

2、孵育完成后用 D.Hanks 液洗滌細(xì)胞兩次，去除未結(jié)合的抗體，最后用 500 μL D.Hanks 液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD29、CD45、CD90、CD34、CD73 和 CDl33 的表達(dá)率。結(jié)果顯示 CD29、CD90、CD73 陽(yáng)性，CD34、CD45、CD133 陰性。

注意事項(xiàng)

（1）采用無(wú)菌操作，避免細(xì)胞污染和外源性微生物感染。

（2）組織處理需要快速、準(zhǔn)確、輕柔，避免細(xì)胞死亡或受損。

（3）組織消化時(shí)間需要嚴(yán)格控制，過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都可能影響細(xì)胞分離和培養(yǎng)。

（4）細(xì)胞培養(yǎng)條件需要嚴(yán)格控制，保持良好的培養(yǎng)環(huán)境，包括溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)液濃度等。

（5）需要對(duì)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的純度和質(zhì)量進(jìn)行鑒定，以確保其應(yīng)用效果和安全性。

（6）細(xì)胞保存應(yīng)采用合適的方法，保證其長(zhǎng)期保存和使用。

常見(jiàn)問(wèn)題

（1）細(xì)胞分離效果不理想：可能是組織消化時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，或者組織處理不當(dāng)，需要注意操作規(guī)范和技巧。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)效果不理想：可能是培養(yǎng)環(huán)境不適宜，如溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)液濃度等，需要調(diào)整培養(yǎng)條件。

（3）細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢：可能是細(xì)胞密度過(guò)低，或者細(xì)胞質(zhì)量不好，需要注意細(xì)胞密度和質(zhì)量的控制。

（4）細(xì)胞污染：可能是操作不嚴(yán)格，或者培養(yǎng)環(huán)境污染，需要注意無(wú)菌操作和環(huán)境衛(wèi)生。

（5）細(xì)胞死亡：可能是組織處理不當(dāng)，或者培養(yǎng)環(huán)境不適宜，需要注意操作規(guī)范和調(diào)整培養(yǎng)條件。

（6）細(xì)胞鑒定不準(zhǔn)確：可能是鑒定方法不準(zhǔn)確，或者細(xì)胞質(zhì)量不好，需要注意鑒定方法和細(xì)胞質(zhì)量控制。

（7）細(xì)胞保存不當(dāng)：可能是保存條件不適宜，如溫度、濕度、保存容器等，需要注意保存條件。