細胞的免疫化學實驗（ICC）
簡介
免疫細胞化學與免疫細胞熒光兩者實現的實驗目的相似，但各有優缺點
| 方法 | 優點 | 缺點 |
| 免疫細胞化學 | 樣品可長期保存 | 一次只能標記一種蛋白 |
| 免疫細胞熒光 | 步驟較簡單，可同時標記不同蛋白，圖片觀賞性強 | 樣品保存時間較短 |
原理
利用抗原-抗體特異性結合的原理，一抗與樣本中目標蛋白發生特異性結合，而能夠與一抗特異性結合的二抗上連接有顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素），顯色劑能夠與顯色底物結合并促使其染色，進而對細胞內抗原進行定位、定性及相對定量的研究。
用途
1、在臨床上，用于病理診斷；
2、其結果可視化，能夠定位目的蛋白的表達及位置（彌補 Westernblot 的不足）；
3、從現象出發，揭示機制；
材料與儀器
1、樣品：貼壁細胞；
2、試劑：4% 多聚甲醛，PBS，Triton X-100、BSA、一抗、生物素二抗、封片劑；
3、器材：6/12/24 孔板、細胞爬片（蓋玻片）、載玻片、濕盒。
步驟
1）按照實驗要求，將細胞植于含有細胞爬片的細胞培養板，置于細胞培養箱培養；
2）植于孔板的細胞穩定過夜后，分組加藥處理，到達時間后，棄掉細胞培養液，用 PBS 清洗 3 次每次 5 min；
3）加入 4% 多聚甲醛進行固定，15~20 min 后使用 PBS 清洗 3 次每次 5 min；
4） 使用 0.1% 的 Triton X 100 打孔 10min，使用 PBS 清洗 3 次每次 5 min；
5） 使用 0.3% 的雙氧水去除內源性過氧化物酶 30 min，PBS 清洗 3 次每次 5 min；
6） 使用 PBS 配制 5% 的 BSA 溶液，每孔 400~500 μL 加入目標孔中，室溫進行封閉1 h；
7） 吸出封閉液，加入稀釋的一抗，以每孔 200 μL 加入目標孔中，4 ℃ 過夜；
6） 吸出一抗，PBS 清洗目標孔 3 次× 5 min。加入生物素二抗孵育 1 h；
7） 吸出二抗，PBS 清洗目標孔 3 次× 5 min。加入 SABC 孵育 1 h；
8） 吸出 SABC，PBS 清洗目標孔 3 次×5 min。加入DAB 顯色 3-5 min；
9） 吸出 DAB，PBS 清洗目標孔 1 次，將細胞爬片片取出，封片，顯微鏡觀察，拍照。
注意事項
1、細胞孔板鋪細胞爬片時，用 PBS 清洗細胞爬片，并用槍頭輕柔均勻往下壓下細胞爬片，趕走爬片與孔板間空氣，以免細胞在爬片與孔板間貼壁生長；
2、為防止細胞脫片，可預先用多聚賴氨酸處理細胞爬片；
3、參考抗體說明書使用抗體稀釋比例；
4、一抗孵育選擇 4 ℃ 過夜孵育，樣品置于濕盒；
常見問題
1、信號弱或者無信號：
1）細胞或組織樣本保存時間過長；
2）抗體濃度不合適，孵育時間不足：參照抗體說明書的適當提高稀釋濃度，延長孵育時間，建議 4 ℃ 過夜孵育；
3）試劑過期或失效，更換試劑；
2、高背景：
1）封閉不充分，適當延長封閉時間；
2）抗體濃度過高；
3）抗體孵育時間過長或溫度過高；
4）清洗不充分，每步清洗 3 次每次 5 min，置于搖床清洗；
3、非特異性染色：
1）實驗步驟錯誤，重復實驗并設立陽性對照組；
2）組織中無抗原：設陽性對照以驗證試驗結果。
