細胞免疫熒光實驗（IF）
簡介
免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進而對抗原所在的細胞或組織進行定性或定量。
| 方法 | 優(yōu)點 | 缺點 |
| 免疫熒光 | 步驟較簡單，可同時標記多種蛋白，圖片偽彩色觀賞性強 | 熒光容易淬滅，樣品保存時間不長 |
| 免疫細胞化學 | 樣品適合長期保存 | 步驟繁瑣，一次只能標記一種蛋白 |
原理
由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。
用途
快速直觀顯示所檢測蛋白的細胞定位。
材料與儀器
【樣品】貼壁細胞；
【試劑】4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；
【器材】6/12/24 孔板，細胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。
步驟
實驗前準備：配置 10% 封閉液；0.2% Triton X-100；
第一天：
1. 取普通潔凈蓋玻片于 75% 乙醇浸泡，無菌超凈臺內(nèi)吹干，將玻片置于 6/12/24 孔板內(nèi)，種入細胞培養(yǎng)液過夜，待細胞長至 30%~60% 滿。
2. 按照特定的實驗?zāi)康奶幚砑毎螅M培養(yǎng)液，用 2/1/0.5 ml PBS 洗兩次，加入 1/0.5/0.25 ml 固定液，室溫固定 15 min。
3. 去除固定液，用 PBS 潤洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。
4. 用 0.2% Triton X-100 室溫通透 5 min，PBS 潤洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。
5. 用封閉液（2/1/0.5 ml/孔）封閉 60 min。
6. 吸去封閉液（勿洗），用一抗（1/0.5/0.25 ml/孔）作用 60 min 或 4 ℃ 過夜，搖床輕搖。
第二天：
7. 去除一抗，PBS 潤洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。
7. 棄 PBS，加入 1/0.5/0.25 ml/孔稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育 40 min，搖床輕搖。
8. 回收熒光二抗，PBS 潤洗 3 次，每次 5 min，搖床輕搖。
滴加 DAPI（200/100/50 μl/孔）避光孵育 5 min，PBS 潤洗 4 次，每次 5 min，洗去多余的 DAPI。用濾紙吸干爬片上的液體，滴 1 滴抗熒光猝滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，避免氣泡，使細胞接觸封片液，熒光顯微鏡觀察綠色熒光。
注意事項
1、建議細胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免最后挑片時造成劃片或細胞片破損以及最后封片可能造成滑片等結(jié)果；
2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細胞植于細胞爬片。
1）建議直接購買處理過的細胞爬片；
2）若只有普通細胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。
然后，用洗潔精搓洗爬片，最后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用；
3、根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；
4、一般 5% BSA 封閉即可達到效果；
5、從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。
6、縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。
7、染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。
8、無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。
9、非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復過度。
10、染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長。
11、通常實驗室先固定細胞再進行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號；
12、建議設(shè)陰性對照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；
13、選擇醛類固定液時，保持其新鮮度，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。
常見問題
1、信號弱或者無信號：
1）細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。
2、高背景：
1）封閉不充分；2）抗體濃度過高；3）抗體孵育時間過長或溫度過高；4）清洗不充分；5）樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中
3、非特異性染色較多：
1）固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；
2）二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。
