細(xì)胞免疫化學(xué)（Immunohistochemistry）

簡(jiǎn)介

免疫細(xì)胞化學(xué)與免疫細(xì)胞熒光兩者實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康南嗨疲饔袃?yōu)缺點(diǎn)

原理

利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，一抗與樣本中目標(biāo)蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而能夠與一抗特異性結(jié)合的二抗上連接有顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素），顯色劑能夠與顯色底物結(jié)合并促使其染色，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究。

用途

1、在臨床上，用于病理診斷；

2、其結(jié)果可視化，能夠定位目的蛋白的表達(dá)及位置（彌補(bǔ)Westernblot的不足）；

3、從現(xiàn)象出發(fā)，揭示機(jī)制；

材料與儀器

1、樣品：貼壁細(xì)胞；

2、試劑：4%多聚甲醛，PBS，Triton X-100、BSA、一抗、生物素二抗、封片劑；

3、器材：6/12/24孔板、細(xì)胞爬片（蓋玻片）、載玻片、濕盒。

步驟

1）按照實(shí)驗(yàn)要求，將細(xì)胞植于含有細(xì)胞爬片的細(xì)胞培養(yǎng)板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

2）植于孔板的細(xì)胞穩(wěn)定過(guò)夜后，分組加藥處理，到達(dá)時(shí)間后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用 PBS 清洗 3 次每次 5 min；

3）加入 4% 多聚甲醛進(jìn)行固定，15~20 min 后使用 PBS 清洗 3 次每次 5min；

4） 使用 0.1% 的 Triton X 100 打孔 10min，使用 PBS 清洗 3 次每次 5min；

5） 使用 0.3% 的雙氧水去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶 30 min，PBS 清洗 3 次每次 5min；

6） 使用 PBS 配制 5% 的 BSA 溶液，每孔 400~500 μL 加入目標(biāo)孔中，室溫進(jìn)行封閉1h；

7） 吸出封閉液，加入稀釋的一抗，以每孔 200 μL 加入目標(biāo)孔中，4℃ 過(guò)夜；

6） 吸出一抗，PBS 清洗目標(biāo)孔 3 次× 5 min。加入生物素二抗孵育1h；

7） 吸出二抗，PBS 清洗目標(biāo)孔 3 次× 5 min。加入 SABC 孵育1h；

8） 吸出 SABC，PBS 清洗目標(biāo)孔 3 次×5min。加入DAB 顯色3-5min；

9） 吸出 DAB，PBS 清洗目標(biāo)孔 1 次，將細(xì)胞爬片片取出，封片，顯微鏡觀察，拍照。

注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞孔板鋪細(xì)胞爬片時(shí)，用PBS 清洗細(xì)胞爬片，并用槍頭輕柔均勻往下壓下細(xì)胞爬片，趕走爬片與孔板間空氣，以免細(xì)胞在爬片與孔板間貼壁生長(zhǎng)；

2、為防止細(xì)胞脫片，可預(yù)先用多聚賴氨酸處理細(xì)胞爬片；

3、參考抗體說(shuō)明書使用抗體稀釋比例；

4、一抗孵育選擇4℃過(guò)夜孵育，樣品置于濕盒；

常見(jiàn)問(wèn)題

1、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：

1）細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；

2）抗體濃度不合適，孵育時(shí)間不足：參照抗體說(shuō)明書的適當(dāng)提高稀釋濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間，建議 4℃ 過(guò)夜孵育；

3）試劑過(guò)期或失效，更換試劑；

2、高背景：

1）封閉不充分，適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間；

2）抗體濃度過(guò)高；

3）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；

4）清洗不充分，每步清洗 3 次每次 5 min，置于搖床清洗；

3、非特異性染色：

1）實(shí)驗(yàn)步驟錯(cuò)誤，重復(fù)實(shí)驗(yàn)并設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組；

2）組織中無(wú)抗原：設(shè)陽(yáng)性對(duì)照以驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。