棕櫚酰化修飾的檢測——熒光共振能量轉移
簡介
作為重要的調節細胞生物學進程的生物分子修飾方式，棕櫚酰化修飾是一種常見的蛋白質修飾方式，通過增加一分子酰基使蛋白質轉化為膜蛋白或膜相關蛋白，它可以影響蛋白質的穩定性、激活性、定位和相互作用等生物學功能。目前熒光共振能量轉移（FRET）技術是一種常用的檢測蛋白質間相互作用的方法，也可以用于檢測蛋白質的棕櫚酰化修飾。
原理
棕櫚酰化修飾是一種重要的蛋白質修飾方式，它涉及到將棕櫚酸基團共價結合到蛋白質上，從而改變蛋白質的生物學性質和功能。棕櫚酰化修飾通常通過酰基轉移酶介導，該酶可以在蛋白質的富含半胱氨酸的 C 末端區域（C-末端區域）識別特定的氨基酸序列，從而將棕櫚酰基團轉移至該氨基酸上。
FRET 是在染色體水平上常用的檢測蛋白質間相互作用的方法，可以在不需分離樣品的情況下實現分子修飾的選擇性檢測和成像，它可以利用熒光蛋白標記來測量蛋白質間的距離和相互作用強度。FRET 也可以用來檢測蛋白質的棕櫚酰化修飾，將接受棕櫚酰化修飾的蛋白質和能夠與其相互作用的蛋白質分別標記上不同的熒光蛋白。
兩個熒光蛋白在足夠靠近時，供體分子吸收一定頻率的光子后會被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移，即發生能量共振轉移，因此可以觀察它們之間的熒光共振能量轉移情況。如果兩個蛋白質之間的距離足夠近，熒光共振能量轉移就會發生，從而導致熒光信號的強度和顏色發生變化。
用途
判斷蛋白質是否發生了棕櫚酰化修飾以及其修飾的位置和程度（強度），從而深入了解棕櫚酰化修飾對蛋白質相互作用的影響。
材料與儀器
耗材：
1. 青蛋白（CFP）和黃蛋白（YFP）：用于標記融合蛋白質。
2. 細胞培養基和培養器材：用于培養細胞并表達融合蛋白質。
3. 熒光顯微鏡和熒光濾光片：用于觀察和記錄 CFP 和 YFP 的熒光信號。
4. 純化柱和親和層析介質：用于純化融合蛋白質。
5. 細胞裂解緩沖液：用于細胞裂解和蛋白質提取。
儀器：
1. 離心機：用于離心細胞和蛋白質。
2. 恒溫振蕩器或培養箱：用于培養細胞。
3. 熒光顯微鏡：用于觀察樣品的熒光信號。
4. 熒光分析儀：用于檢測和分析 FRET 信號。
5. 活細胞成像系統：用于觀察和記錄細胞內蛋白質的 FRET 信號變化。
6. 多功能酶標儀：用于檢測和定量蛋白質濃度和純度。
步驟
1、制備熒光蛋白質標記物
首先需要制備兩種熒光蛋白質標記物，一種用于標記被棕櫚酰化修飾的蛋白質，另一種用于標記未被修飾的蛋白質。這兩種標記物需要發射波長相近的熒光信號，但接受波長卻不同，這樣才能實現 FRET 檢測。通常使用青蛋白（Cyan fluorescent protein，CFP）和黃蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）作為標記物，它們具有良好的光學性能和光譜重疊度。
2、構建融合蛋白
將待檢測的蛋白質序列與 CFP 或 YFP 序列融合，構建融合蛋白，使得 CFP 和 YFP 相對靠近，且 YFP 位于 CFP 的 C 端。這樣，當蛋白質被棕櫚酰化修飾后，CFP 和 YFP 之間的距離就會發生變化，從而影響 FRET 信號的強度。
3、表達和純化融合蛋白
將融合蛋白質轉化到宿主細胞中進行表達，然后利用親和層析等技術純化融合蛋白。
4、檢測 FRET 信號
將純化的融合蛋白質在熒光顯微鏡下進行觀察，同時使用 CFP 和 YFP 的激發波長激發蛋白質樣品，記錄 CFP 和 YFP 的熒光信號。通過計算 CFP 和 YFP 之間的 FRET 效率，可以確定蛋白質是否被棕櫚酰化修飾以及修飾程度。如果蛋白質被修飾，則 CFP 和 YFP 之間的距離會增加，FRET 信號會變弱。
需要注意的是，FRET 檢測需要使用專業的熒光顯微鏡和熒光信號分析軟件，同時需要對熒光標記物的性能和實驗條件進行優化，以獲得準確和可重復的結果。
注意事項
1. 熒光蛋白的選擇：選擇適合的熒光蛋白對進行標記，通常使用的是熒光蛋白對中的黃色熒光蛋白（YFP）和青色熒光蛋白（CFP）。標記的熒光蛋白要有足夠的亮度和相當的熒光光譜重疊度，以確保 FRET 實驗的準確性和靈敏度。
2. 標記位置的選擇：標記的熒光蛋白應該位于棕櫚酰化修飾區域內和區域外，以便比較檢測到的 FRET 信號的強度，從而判斷蛋白質是否發生了棕櫚酰化修飾。
3. 標記的濃度：標記的熒光蛋白的濃度需要適當控制，過高的濃度會導致熒光共振能量轉移的非特異性增加，從而影響實驗結果的準確性。一般來說，熒光蛋白的濃度應該控制在適當的范圍內，以確保實驗的靈敏度和準確性。
4. 控制樣品的處理方式：在樣品的處理過程中需要采用適當的方式，以避免棕櫚酰化修飾的丟失或者不必要的修飾。比如，在免疫共沉淀實驗中可以采用抑制酰化酶的方法來避免不必要的棕櫚酰化修飾。
5. 采用適當的控制實驗：為了排除非特異性的 FRET 信號和其他干擾因素，需要采用適當的控制實驗。例如，可以采用未標記的蛋白作為陰性對照，或者通過破壞蛋白質相互作用的特定氨基酸序列來檢驗實驗結果的特異性。
6. 制備質量控制樣品：制備質量控制樣品用于驗證實驗的準確性和可重復性。質量控制樣品應該與實驗樣品相似，并且應該進行多次重復實驗以確保實驗結果的可靠性和一致性。
7. 注意實驗操作的細節：在實驗操作過程中，需要注意實驗操作的細節和實驗條件的控制。例如，需要控制實驗室環境的光照和溫度，以及實驗器材和試劑的質量和純度，以確保實驗的可重復性和準確性。
