大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

簡(jiǎn)介

將目的基因片段插入特定載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞大腸桿菌中誘導(dǎo)其大量表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。

原理

原核表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建→轉(zhuǎn)化到高效表達(dá)的宿主菌→目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)→細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng)→制備細(xì)菌蛋白粗提物→目的蛋白質(zhì)的純化。

設(shè)計(jì)含有 His 標(biāo)簽的目的基因引物，通過(guò)克隆手段構(gòu)建能在大腸桿菌中表達(dá)的重組基因質(zhì)粒載體，隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，通過(guò) IPTG 誘導(dǎo)，大腸桿菌會(huì)高表達(dá)目的蛋白，將大腸桿菌破碎后，目的蛋白溶解于上清中，Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有 His（組蛋白）標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合。

在蛋白上柱后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni 柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以也可以與咪唑結(jié)合，咪唑與 His 標(biāo)簽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合在 Ni 柱上，因此我們利用低濃咪唑洗脫雜蛋白，利用高濃度咪唑梯度洗脫目的蛋白，收集洗脫液，最后通過(guò)透析去除咪唑就能獲得目的蛋白。

用途

可用于體外大量純化目的蛋白，做 pull-down 實(shí)驗(yàn)、純化蛋白產(chǎn)物等等。

材料與儀器

1、誘導(dǎo)表達(dá)材料

（1）LB（Luria—Bertani）固體培養(yǎng)基

酵母膏（Yeast extract）5 g

蛋白胨（Peptone）10 g

NaCl 10 g

瓊脂（Agar）1~2%

蒸餾水（Distilledwater）1 000 ml pH 7.0

（2）LB（Luria—Bertani）液體培養(yǎng)基

酵母膏（Yeast extract）5 g

蛋白胨（Peptone）10 g

NaCl 10 g

蒸餾水（Distilledwater）1 000 ml pH 7.0

（3）IPTG 貯備液：

2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸餾水中，

0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，分裝成 1 mL/份，-20 ℃ 保存。

2、大腸桿菌破碎材料——超聲破碎法

（1）超聲緩沖液：

20 mM Tris-HCL（PH 根據(jù)目的蛋白情況決定，一般避開(kāi)蛋白的等電點(diǎn)，約為 7 左右）;

400 mM NaCl（鹽濃度也依據(jù)蛋白的性質(zhì)決定，鹽濃度越高越不易沉淀形成包涵體）；

（2）清洗緩沖液：超聲緩沖液中＋30 mM 咪唑；

（3）洗脫緩沖液：超聲緩沖液中＋100 mM、200 mM、300 mM、400 mM、500 mM 咪唑。

步驟

1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)

（1）設(shè)計(jì)含有 His 標(biāo)簽的目的基因引物。

（2）構(gòu)建目的蛋白與 His 標(biāo)簽的融合基因，連接于大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒當(dāng)中。

（2）將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌（如 BL21），涂于液體 LB 培養(yǎng)基上，37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)。

（3）挑取單菌落，接種于 50 ml 液體 LB 培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)。

（4）擴(kuò)大培養(yǎng)，依據(jù) 1:100 的接種量，將菌液接種至大型 LB 液體培養(yǎng)基當(dāng)中，37 ℃ 培養(yǎng)。

（5）培養(yǎng)條件：根據(jù)不同啟動(dòng)子及菌種類型調(diào)整蛋白誘導(dǎo)的條件。例如，在 BL21 中表達(dá) T7 啟動(dòng)子的工程菌，菌液渾濁后測(cè)量培養(yǎng)液的 OD600 達(dá) 0.4~0.6，迅速使溫度降至 16 ℃ 進(jìn)行 IPTG 誘導(dǎo)，誘導(dǎo)濃度為 11 mmol/L，誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，進(jìn)行收菌，裂解。

2、大腸桿菌分離與蛋白質(zhì)純化

1）細(xì)菌的裂解

常用方法有：① 高溫珠磨法；② 高壓勻漿；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化學(xué)滲透等。后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛，下面主要介紹超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟。

超聲破碎法：聲頻為 15~20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染色體 DNA 進(jìn)行剪切，大大降低液體的粘稠度。

① 收集 1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，4 ℃，5 000 rpm 離心，15 min；棄上清，約每克濕菌加 3 ml 超聲緩沖液。

② 按超聲處理儀廠家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌（如超聲 4 s，停頓 6 s，功率 40%）；10 000 g 離心，15 min，分別收集上清液和沉淀。

2）鎳柱純化

① 將上清收集過(guò) Ni 柱，二次流穿，收集流穿后的上清。

② 用體積約 100 ml 的清洗緩沖液清洗鎳柱

③ 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂孟鄳?yīng)體積的洗脫緩沖溶液，根據(jù)咪唑的梯度洗脫目的蛋白，收集不同咪唑濃度洗脫下的蛋白。此步驟如果再預(yù)裝柱及蠕動(dòng)泵中可自動(dòng)化，無(wú)需配置梯度溶液。

④ 可以選用適宜孔徑大小的濃縮柱將蛋白濃縮。

⑤ 分別取各個(gè)步驟的留樣及最后的洗脫下的目的蛋白，加入等體積的 2×凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行 SDS-PAGE 跑膠，隨后考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)是否純化到目的蛋白。

注意事項(xiàng)

（1）超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng) 3~4 次凍溶后更容易破碎。

（2）盡量每個(gè)步驟的上清與沉淀都收集起來(lái)，最后用 SDS-PAGE 檢測(cè)樣品，能判斷出那個(gè)步驟實(shí)驗(yàn)有誤。

（3）根據(jù)不同啟動(dòng)子及菌種類型調(diào)整蛋白誘導(dǎo)的條件。如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為 PL 啟動(dòng)子，則在 30~32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，使培養(yǎng)液的 OD600 達(dá) 0.4~0.6，迅速使溫度升至 42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng) 3~5 h；如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為 tac 等，則 37 ℃ 培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加 IPTG 至終濃度為 1 mmol/L。繼續(xù)培養(yǎng) 3~5 h。

（4）純化蛋白應(yīng)根據(jù)蛋白特性的不同更改純化調(diào)節(jié)，例如應(yīng)盡量避開(kāi)蛋白等電點(diǎn)，避免蛋白的沉淀；例如某些蛋白容易降解所以應(yīng)在低溫環(huán)境下操作，避免蛋白過(guò)快降解；某些蛋白表達(dá)較低，可提高 IPTG 工作濃度或增加誘導(dǎo)時(shí)間。

常見(jiàn)問(wèn)題

蛋白質(zhì)在細(xì)菌中的高水平表達(dá)，常形成相差顯微鏡下可見(jiàn)到的細(xì)胞質(zhì)顆粒，即為包涵體，經(jīng)離心沉淀后可用 Triton-X100/EDTA 或尿素洗滌，若為獲取可溶性的活性蛋白，須將洗滌過(guò)的包涵體重新溶解并進(jìn)行重折疊。洗滌液 I 配方如下：

0.5% TritonX-100

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

（1）細(xì)胞裂解混合物 12 000 g 離心，15 min，4 ℃；棄上清，沉淀用 9×洗滌液 l 懸浮；室溫放置 5 min；12 000 g 離心 15 min，4 ℃；吸出上清，用 100 μl 水重新懸浮沉淀；分別取 10 μl 上清和重新懸浮的沉淀，加 10 μl 2×凝膠電泳加樣緩沖液，進(jìn)行 SDS-PAGE。

（2）包涵體的溶解和復(fù)性

① 緩沖液 I：

1 mmol/L PMSF

8 mol/L 尿素

10 mmol/L DTT

溶于前述裂解緩沖液中。

② 緩沖液Ⅱ：

50 mmol/L KH2PO4

1 mmol/L EDTA（pH8.0）

50 mmol/L NaCI

2 mmol/L 還原型谷胱甘肽

1 mmol/L 氧化型谷胱甘肽

③ KOH 和 HCI。

（2）用 100 μl 緩沖液 I 溶解包涵體；室溫放置 l h；加 9×緩沖液Ⅱ，室溫放置 30 min，用 KOH 調(diào) pH 到 10.7；用 HCI 調(diào)至 pH 8.0，在室溫放置至少 30 min； 1 000 g 離心，15 min，室溫；吸出上清液并保留，用 100 μl 2×凝膠電泳加樣緩沖液溶解沉淀；取 10 μl 上清，加 10 μl 2×凝膠電泳加樣緩沖液，與 20 μl 重新溶解的沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE。