棕櫚酰化修飾的檢測——免疫印跡

簡介

蛋白質棕櫚酰化修飾是一種可逆的翻譯后脂質修飾，通常被認為可以調節蛋白質的亞細胞定位。

原理

首先使用樹脂輔助捕獲酰化蛋白結合免疫印跡評估蛋白棕櫚酰化修飾水平。

免疫印跡是將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離， 然后取固定化基質膜與凝膠相貼。

在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下， 使凝膠中的單一抗原組份轉移到印跡紙上， 并且固相化。

最后應用免疫覆蓋液技術如免疫同位素探針或免疫酶探針等， 對抗原固定化基質膜進行檢測和分析。

用途

檢測某種蛋白是否發生了棕櫚酰化修飾，配合質譜技術可以找到具體的棕櫚酰化修飾的位點。

材料與儀器

試劑：

NEM、無水乙醇、蛋白酶抑制劑、ddH2O

HEPES、EDTA、SDS

HRP 標記的山羊抗兔抗體、HE 染色試劑盒

快速配膠試劑盒、PVDF 膜

儀器：

冰箱、pH 計、離心機、電泳儀

化學發光成像系統

步驟

1、試劑配制

1）2 M NEM：0.25 g NEM 粉末 + 1 mL 無水乙醇；

1 M DTT：1.54 g DTT粉末 + 10 mL 0.01 M 乙酸鈉；

0.01 M 乙酸鈉：1.36 mg 乙酸鈉粉末 + 1 mL ddH2O；

2 M 羥胺（HAM）：613 μL HAM + 10 mL ddH2O；

1 M HEPES：2.38 g HEPES + 10 mL ddH2O；

0.1 M EDTA：0.37 g EDTA + 10 mL ddH2O。

2）Blocking Buffer（10 mL）：100 mM HEPES + 1 mM EDTA + 2.5% SDS 粉末 + 50 mM NEM（現用現加），使用前調 pH = 7.5，并加蛋白酶抑制劑。

3）Binding Buffer（10 mL）：100 mM HEPES + 1 mM EDTA + 1% SDS 粉末，使用前調 pH = 7.5，并加蛋白酶抑制劑。

2、捕獲酰化蛋白

1）取待測蛋白樣品，將含有 NEM 的 Blocking Buffer 加入蛋白溶液中，常溫孵育 10 分鐘，NEM 可封閉蛋白質半胱氨酸 Cys 上所有自由巰基。

2）沉淀蛋白：將封閉后的樣本加入 3 倍體積的冷丙酮（負 20 度先預冷好），放入負 20 度沉淀 3 小時。5000 g，離心 10 分鐘，棄上清，留沉淀。

3）用 70% 的丙酮洗滌沉淀兩次，用 Binding Buffer 重懸沉淀，沉淀很硬，先用槍頭吹打，再用針頭混勻。

4）取 300 μL 作為 Input 組，加 100 μL 的 4X 蛋白上樣緩沖液 Loading Buffer，煮 10 分鐘，負 20 度保存。

5）取 0.05 g 硫丙基瓊脂糖 6B，每個樣備兩個管子（HAM-， HAM+），用 1.5 mL ddH2O 重懸混勻，5000 rcf，離心 3 分鐘，吸去上清；再用 1.5 mL ddH2O 洗滌硫丙基瓊脂糖 6B 兩次，5000 rcf，離心 3 分鐘，吸去上清。

6）將每個樣的樣本平均分成兩份，加入含有硫丙基瓊脂糖 6B 的兩個管子（HAM-， HAM+），HAM- 組：加 NaCl 作為對照；HAM+ 組：加 2M 的 HAM（羥胺），4 度，過夜孵育。

7）以 5000 g 離心 3 分鐘，去上清。瓊脂糖用 1 mL Binding Buffer + 8 M urea，洗滌 5 分鐘，共 5 次。加入 150 μL 的 Binding Buffer + 50 mM DTT，常溫孵育 20 分鐘。

8）5000 g，離心 3 分鐘，取上清，加 4X 蛋白上樣緩沖液 Loading Buffer，煮 10 分鐘，負 20 度保存。

3、WB檢測

1）配置合適濃度的分離膠和濃縮膠（快速配膠試劑盒）。

2）在加樣孔內加入等量的步驟 2 得到的待測蛋白樣本以及蛋白 marker。110 V 恒壓電泳，待溴酚藍跑至波板邊緣的位置停止電泳（根據需要可延長或縮短電泳時間）。

3）配置電轉液：6.06 g Tris + 28.8 g 甘氨酸 + 400 mL 甲醇，ddH2O 定容至 2 L。根據目的蛋白的分子量切膠，活化 PVDF 膜（將膜依次置于甲醇，ddH2O，電轉液），在轉膜的夾板上依次放上海綿，濾紙，膠，膜，濾紙，海綿，合上并夾緊夾板，放入轉膜筐，250 mA 恒流轉膜。

4）配置 TBST：18 g NaCl + 6 g Tris + Tween20 2 mL + 濃鹽酸 2 mL，ddH2O 定容至 2 L。

5）配置封閉液：BSA:TBST = 3g:100mL，按每張膜 4 mL 的量加入膜條帶孵育盒。

6）轉膜完成后，將膜條帶置于封閉液中，37 度搖床，1 小時。

7）孵育一抗，按照抗體說明書用封閉液稀釋一抗原液，將條帶置于一抗中，4 度過夜孵育。TBST 中洗 3次，每次 10 分鐘。

8）將條帶放入稀釋好的二抗中，室溫孵育 1 小時。 TBST 中洗 3 次，每次 15 分鐘。

9）配置顯影液，均勻覆蓋條帶，放入顯影儀顯影，保存圖片。

注意事項

蛋白樣品要注意保持活性，低溫輕柔操作。

常見問題

棕櫚酰化修飾的豐富可能比較低，比較難以檢測，可以嘗試使用點擊化學法、生物學交換法等來檢測。