芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)

簡介

蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)是將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入宿主細(xì)胞用于表達(dá)蛋白質(zhì)的方法，按照宿主細(xì)胞來劃分，蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。

原核表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)等，真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母菌表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)和植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。

其中芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)，因具有外源蛋白易分離純化、表達(dá)的外源蛋白不會形成包涵體、無致病性等多種優(yōu)勢而被廣泛的研究和應(yīng)用。

原理

芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌和重要的原核表達(dá)宿主，細(xì)胞只有一層膜結(jié)構(gòu)，分泌系統(tǒng)完善，可以直接將許多蛋白分泌到培養(yǎng)基中，表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不易形成包涵體，無需細(xì)胞破碎，無胞內(nèi)蛋白污染，有利于后續(xù)分離純化。

用途

用于酶制劑、多肽類藥物等多種外源蛋白的分泌表達(dá)。

材料與儀器

大腸桿菌 DH5α、LB 培養(yǎng)基、2 mL EP 管、質(zhì)粒提取試劑盒、芽孢桿菌相對應(yīng)的培養(yǎng)基

步驟

1. 將目的基因連接到穿梭的表達(dá)載體上，載體中通常包含啟動子、選擇性標(biāo)志基因和表達(dá)縮短型的蛋白質(zhì)所需要用到的基因信息，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α感受態(tài)中，涂在含相應(yīng)抗性的 LB 平板上，37 ℃ 過夜培養(yǎng)。

2. 篩選陽性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)入 LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 rpm/min 培養(yǎng) 12~16 h，取 2~4 mL 菌液于 2 mL 的 EP 管中，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。

3. 將凍存于 -80 ℃ 的芽孢桿菌菌液在 LB 平板上劃線，放置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng) 12~16 h，挑取單菌落接種于對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，制作芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

4. 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂對應(yīng)的抗性平板，37 ℃ 培養(yǎng)過夜。

5. 挑取單克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，篩選出理想的目的菌株。

6. 將目的菌株接入 10 mL 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)作為一級種子液。

7. 取 5 mL 的一級種子液接入 100 mL 液體培養(yǎng)基中，在 37 ℃ 培養(yǎng)至 OD600=0.8~1.0，加入誘導(dǎo)劑（誘導(dǎo)劑的終濃度為 1%），37 ℃，200 rpm/min 培養(yǎng) 12 h 結(jié)束發(fā)酵。

8. 取培養(yǎng)中不同時間溫度表達(dá)的蛋白進(jìn)一步做蛋白分析，選擇最優(yōu)的表達(dá)條件。

9. 進(jìn)行放大培養(yǎng)并純化蛋白。

注意事項

（1）芽孢桿菌擁有很強(qiáng)的胞外蛋白分泌能力，其外源蛋白的表達(dá)量并不是很高，需要進(jìn)行發(fā)酵條件篩選。

（2）接種量根據(jù)實驗具體情況而定，誘導(dǎo)時間根據(jù)表達(dá)蛋白的具體情況而定，選擇合適的表達(dá)溫度和時間。

（3）芽孢桿菌最常見的誘導(dǎo)性啟動子是受 IPTG 誘導(dǎo)的啟動子和受木糖誘導(dǎo)的啟動子。

常見問題

（1）芽孢桿菌的野生菌會產(chǎn)生大量的胞外蛋白酶，容易使目標(biāo)產(chǎn)物在被降解。因此可使用蛋白酶缺陷型菌株以提高外源蛋白的表達(dá)水平。

（2）注意表達(dá)載體缺乏，載體不穩(wěn)定、蛋白質(zhì)易變性等問題。