蛋白過(guò)鎳柱純化
簡(jiǎn)介
在重組蛋白表達(dá)純化的過(guò)程中 His-Tag 是最為常見(jiàn)的標(biāo)簽，對(duì)于大多數(shù)蛋白（可溶或包涵體）都可以使用該方法進(jìn)行初步的純化。
原理
Ni2+ 能夠螯合配體填充并固定在層析介質(zhì)上，組氨酸（His）帶有一個(gè)咪唑基團(tuán)，該基團(tuán)能夠與 Ni2+ 形成配位鍵并選擇性結(jié)合，而不帶有 His 殘基的蛋白不能與 Ni2+ 形成配位鍵并結(jié)合，這樣便能有效地將目的蛋白（具有 His-Tag 的蛋白）與非目的蛋白進(jìn)行有效區(qū)分。
隨后通過(guò)高濃度的咪唑緩沖液與 His-Tag 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 Ni2+，將目的蛋白洗脫并進(jìn)行收集，從而得到較為純凈的目的蛋白。
用途
純化帶有 His 標(biāo)記的目的蛋白。
材料與儀器
Ni2+ 親和柱、0.2 M NiSO4 溶液
100 mM EDTA 溶液、0.2 M NaOH 溶液
ddH2O、0.22 μm 濾膜
結(jié)合緩沖液：低濃度咪唑緩沖液
洗脫緩沖液：高濃度咪唑緩沖液等
步驟
1、Ni2+ 親和柱的重生
1）將 Ni2+ 親和柱接在泵頭上，使用 ddH2O 沖洗 5 個(gè)柱體積。
2）隨后更換為 EDTA 溶液沖洗 5 個(gè)柱體積，使用 ddH2O 沖洗 5 個(gè)柱體積。
3）使用 0.2 M NaOH 溶液沖洗 5 個(gè)柱體積，使用 ddH2O 沖洗 10 個(gè)柱體積。
4）使用 NiSO4 溶液填充親和柱，沖洗 5 個(gè)柱體積，使用 ddH2O 沖洗 5 個(gè)柱體積。
以上 Ni2+ 親和柱重生完畢。
2、Ni2+ 親和柱的平衡
將 Ni2+ 親和柱接在泵頭上，使用低濃度咪唑鹽緩沖液沖洗 5 個(gè)柱體積。
3、帶有 His-Tag 的目的蛋白與 Ni2+ 親和柱結(jié)合
1）將表達(dá)蛋白的菌液放入高速離心機(jī)離心，5000 rpm、4 °C、10 分鐘，收集菌塊，-20 ℃ 或 -80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/span>
2）使用低濃度咪唑緩沖液將菌塊重懸。
3）在冰浴條件下，使用壓力破碎儀或超聲破碎儀釋放表達(dá)的蛋白，超聲破碎儀不盡相同需優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。若超聲后菌液依然渾濁，需適當(dāng)增加功率，延長(zhǎng)超聲時(shí)間。
4）將懸液置于超高速離心機(jī)中，4 °C，18000 rpm，25 分鐘，分離上層蛋白清液和沉淀。
5）SDS-PAGE 電泳檢測(cè)：確定蛋白是可溶性（上清）表達(dá)還是包涵體（沉淀）表達(dá)。
6）Ni2+ 親和柱接在泵頭上，在 4 °C 條件下將蛋白裂解液慢速恒速通過(guò)Ni2+ 親和柱。
7）使用低濃度咪唑緩（10 mM 咪唑）沖液 2~5 mL/min 流過(guò) Ni2+ 親和柱，約 5 個(gè)柱體積。
8）用分別含 50、100、200、300、400 mM 咪唑緩沖液進(jìn)行階段洗脫，流速為 2~5 mL/min，收集各階段洗脫峰，每個(gè)濃度咪唑緩沖液流過(guò) 2 個(gè)柱體積。
9）收集得到蛋白樣品用 SDS-PAGE 檢測(cè)融合蛋白的分子量大小和純度。
10）用 ddH2O 沖洗 Ni2+ 親和柱 5 個(gè)柱體積，再用 20% 的乙醇沖洗 Ni2+ 親和柱 3 個(gè)柱體積，流速為 2~5 mL/min，柱子始終置于低溫環(huán)境中保存。
11）對(duì) SDS-PAGE 檢測(cè)得到的高純度蛋白進(jìn)行濃縮，并在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行緩沖液置換和下一步純化實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1. 在設(shè)計(jì)重組蛋白時(shí)通常建議在 C 端或 N 端添加 6 個(gè) His-Tag 標(biāo)簽，確保表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功且 IPTG 誘導(dǎo)重組菌表達(dá)的濃度合適，設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)判定后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。
2. His-Tag 的分子量非常小，幾乎不會(huì)影響目的蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。
3. His-Tag 往往被設(shè)計(jì)在 N 端，這樣與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄機(jī)制能夠更好的兼容。
4. 如果實(shí)驗(yàn)室條件較好，可以應(yīng)用 ?KTATM 系統(tǒng)進(jìn)行蛋白的自動(dòng)純化。
5. 所用到的緩沖液都應(yīng)該過(guò) 0.22 μm 濾膜。
6. 蛋白在高濃度咪唑鹽中保存往往會(huì)變形，應(yīng)該盡快進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行緩沖液置換。
7. 緩沖液配方多樣，常用 pH 7.4 的 PBS 溶液加不同濃度的咪唑鹽。
8. 實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有超高速離心機(jī)，可以使用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾壓力破菌儀或超聲破菌儀釋放表達(dá)的蛋白懸液。
9. 柱子長(zhǎng)時(shí)間不用應(yīng)將內(nèi)部的 Ni2+ 洗脫干凈，并使用 20% 乙醇溶液進(jìn)行冷藏保存，防止微生物生長(zhǎng)。
10. 每次填充的 Ni2+ 親和柱使用三次后應(yīng)當(dāng)再次重生，以提高純化效率。
11. 需設(shè)計(jì)預(yù)確定蛋白是可溶性（上清）表達(dá)還是包涵體（沉淀）表達(dá)。
常見(jiàn)問(wèn)題
1.蛋白不掛柱
1）首先判斷目的蛋白是否具有良好的水溶性，如果目的蛋白水溶性較差，建議添加 MBP 標(biāo)簽增加蛋白的水溶性。
2）可能在裂菌的過(guò)程中蛋白沒(méi)有完全釋放，可以增大壓力、超聲的功率或者破菌時(shí)間以及添加適量的溶菌酶。
3）上層蛋白清液應(yīng)用較慢的流速恒流通過(guò) Ni2+ 親和柱，可以循環(huán)掛柱 2~3 次。
4）His-Tag 沒(méi)有完全暴露，可以在裂菌過(guò)程中添加 1% 甘油或 2~5 mM DTT/β-巰基乙醇，使得 His-Tag 充分暴露。
2. 目的蛋白洗脫不下來(lái)
提高洗脫液中 Ni2+ 的濃度，或增加 NaCl 和非離子去污劑的濃度。注意高濃度 NaCl 可能會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。
3. 在 SDS-PAGE 檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雜蛋白條帶較多
1）提高低濃度咪唑緩沖液的咪唑濃度。
2）使用多標(biāo)簽多步純化，例如添加 MBP-Tag 標(biāo)簽即可使用 MBP 親和柱進(jìn)行進(jìn)一步純化。或根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)，利用 HP/Q 柱進(jìn)行純化，最后可以通過(guò)蛋白的分子量大小利用 SEC 柱進(jìn)行蛋白分子量區(qū)分。
4. 在沖洗過(guò)程中柱子進(jìn)空氣了
將柱子倒掛在泵頭上，使用較快流速?zèng)_洗結(jié)合緩沖液或 ddH2O 10~20 個(gè)柱體積，將氣體全部排空。
