細胞 DNA 損傷檢測

原理

細胞 DNA 鏈斷裂時，DNA 的超螺旋結構受到破壞，在中性條件時，DNA 片段可進入凝膠發生遷移，而在堿處理和堿性電解質的作用下，DNA 發生解螺旋，損傷的 DNA 斷鏈及片段被釋放出來，由于這些 DNA 的分子量很小，所以在電泳過程中會離開核 DNA 向陽極移動，形成彗星狀的拖尾圖像，而未損傷的 DNA 部分停留在原位，染色后成圓形熒光團。

用途

評價單個細胞的 DNA 損傷（各種因素的生物反應、腫瘤的研究治療預測）。

材料與儀器

【試劑】低熔點瓊脂糖、正常熔點瓊脂糖

PBS、TBE（5X）、溴化乙錠（EB）

Tris-HCl 溶液、RIPA 細胞裂解液

載玻片、蓋玻片

【設備】熒光顯微鏡、核酸電泳儀

步驟

1、單細胞懸液制備

用胰酶將細胞消化至離心管中并進行細胞計數，用 PBS 調節細胞密度至 105~106 個/ml。

2、制膠

第一層使用 80 μl 0.5% 正常熔點瓊脂糖滴到預熱的載玻片上，迅速蓋上干凈的蓋玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第二層是低熔點瓊脂糖與細胞的混合液，取 10 μl 含 10000 個細胞的 PBS 和 75 μl 0.5% 低熔點瓊脂糖在 37 ℃ 混勻，然后輕輕揭去蓋玻片，將含細胞的低熔點瓊脂糖滴到第一層膠板上，立即蓋上干凈的蓋玻片，4 ℃ 放置 10 min 使其凝固。

第三層膠制備同第一層膠一致，蓋上蓋玻片。

3、裂解

移去蓋玻片，將載玻片浸入新配置的 RIPA 細胞裂解液中至少裂解 2.5 h（盡量使每張玻片裂解時間相同）。此步驟的目的是裂解液由去垢劑及高鹽溶液組成，除去溶解細胞膜及核膜，除去蛋白質、RNA 等，僅存留核骨架。

4、解旋和電泳

細胞裂解后，取出載玻片，用 PBS 沖洗 2 次，然后將載玻片置于水平電泳槽中，倒入 1XTBE 電泳緩沖液，覆膠面 0.25 cm，堿解旋 20 min，4 ℃ 冰箱中電泳 25~30 min，電壓 25 V。

5、染色

將載玻片取出，濾紙吸干電泳緩沖液，用 Tris-HCl（pH 7.5）中和 15 min。然后每片載玻片上滴加 50 μl 30 μg/mL 的溴化乙錠（EB）溶液，避光操作，蓋上蓋玻片，避光染色 20 min，即可觀察。

6、鏡檢核圖像分析

EB 染色后的樣本盡快在熒光顯微鏡下觀察并拍照電泳圖譜。

注意事項

1、細胞消化不徹底，沒有得到單個細胞，多個細胞發生粘連。

2、尾巴形狀不完全或者發生扭曲。

3、裂解液處理是本實驗的關鍵，裂解液要澄清且完全溶解，裂解不徹底要延長裂解時間或考慮使用強裂解液。

4、溴化乙錠是劇毒物質，需做好防護，可考慮用其他核酸染料替代。

常見問題

問題1：細胞消化不徹底，沒有得到單個細胞，多個細胞發生粘連。

答：細胞消化過程在孵箱中進行消化，可以用移液槍輕輕吹吸。

問題2：尾巴不完整或者發生扭曲。

答：制膠過程細致小心，不要產生氣泡、膠面平整。剝膠過程小心細致。電泳保持在低電壓且電壓平穩，在 4 ℃ 冰箱里電泳。