實時熒光定量 PCR-FP 技術

原理

帶熒光標記的寡核苷酸探針分子小，偏振光弱。當探針與 DNA 上的特異片段結合后分子量增大，偏振光增強。在 PCR 擴增時，隨著引物介導的新鏈形成，探針從模板上解離下來，重新成為游離狀態，偏振光又減弱。

在每一個 PCR 循環退火階段，探針又可與 DNA 鏈重新配對，偏振光增強。在此階段檢測偏振光的增值，可對其進行定量檢測。而當所擴增的核酸序列中不含與探針相配對的特定 DNA 片段時，熒光探針無法與核酸序列配對，其熒光偏振值很弱。故可檢測擴增核苷酸序列中是否含有目的 DNA 片段。

用途

通過熒光強度和標準品濃度制作工作曲線，檢測目的基因、對目的基因進行定量。

材料與儀器

MJ Research V2.0；Victor Ⅱ熒光偏振檢測儀；dNTPs、Taq DNA 聚合酶、血清標本、引物和探針。

步驟

1、血清處理：在 30 μl 血清標本中加 30 μl 處理液（10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0 1 mmol/L EDTA、1 ml/L NP40）于離心管中煮沸 15 min，7 000 r/min 離心 5 min。吸取上清液 2 μl 作模板。

2、PCR 擴增反應和液相雜交: 取 2 μl 模板加到 28 μl PCR 反應液中（10×PCR 緩沖液 3 μl，dNTPs 各 160 μmol/L，上游通用引物 C1 和下游通用引物 C2 各 3 pmol，探針 1.5 pmol，Taq DNA 聚合酶 1 U）。PCR 程序：94 ℃、2 min 后進入循環，94 ℃、5 s，60 ℃、55 s，72 ℃、45 s，循環 25 次，最后 94 ℃、5 s，45 ℃、20 s。

3、探針雜交：取 10 μl 雜交后的 PCR 產物加入含有 45 μl 雜交液（其中含 1 g/L 聚乙二醇 4 000，300 ml/L  DMSO，6×SSC（pH10），0.01 mol/L 磷酸鈉（pH 8.0），1 mmol/L  EDTA（pH8.0），5 g/L  SDS，100 μg/ml 變性鮭魚精 DNA，5 g/L 脫脂奶粉）的用于熒光偏振檢測的微孔中，混勻后 40 ℃ 水浴放置 10 min，然后用 Victor Ⅱ 熒光偏振檢測儀檢測熒光素 R110 的偏振值。

4、判定標準計算: 本實驗方案以檢測 HBV DNA 血清樣本為例，隨機選 10 份 HBV DNA 陰性血清和 10 份 HBV DNA 陽性血清進行檢測，cut off 值＝陰性樣本結果的平均偏振光值＋10％×陽性樣本結果的平均偏振光值。偏振光值＞cut off 值×110％ 的樣本為陽性，＜cut off 值×90％ 的樣本為陰性, 而在 2 個界限內（包括界限值）的樣本為＋/－。判斷標準為：cut off＝60 mp，那么陰陽性判斷標準為 54 和 66 mp。

注意事項

1、在 FP 檢測中，被標記分子的大小是有限制的，對于特定的熒光團，增加分子量會降低潛在的檢測窗口；

2、被標記分子的可允許大小也取決于標記的熒光壽命；

3、熒光標記分子大小<1.5 kD 最佳。