α 突觸核蛋白硫磺素T檢測操作步驟

原理

硫黃素 T (Thioflavin T) 是一種熒光染料，可以和富含 β 折疊的結構結合，例如 α-突觸核蛋白原纖維。一旦結合，硫黃素T 的發射光譜就會發生紅移 ，并且熒光強度會增強，這是一個很好的用來檢測原纖維形成的測試。以下是用 α-突觸核蛋白前體原纖維和單體做的硫黃素T 檢測的操作指南。

材料與儀器

材料：硫黃素T、PBS、蒸餾水、0.2μm 注射器過濾器、96 多孔孔板

儀器：移液器、全波長熒光型酶標儀、震蕩孵育器

步驟

1. 用蒸餾水制備 1mM 硫黃素T 儲備溶液 (新鮮制備并使用 2μm 注射器過濾器過濾)。

2. 用 PBS pH7.4 稀釋硫黃素T，確保每個孔中的硫黃素T最終濃度為 25μM (每孔溶液體積= 100μL). 孔板: 96 多孔孔板.

3. 在將要使用之前才把 alpha 突觸核蛋白小份在室溫下解凍。

4. 在相應的孔中加入 10μM 前體原纖維或者 100μM 單體 (或兩者都有). 用移液器將孔中液體上下吸入排出混合. 濃度為估計值，需要優化來得到好的信號，并避免浪費。

5. 密封孔板然后置于震蕩孵育器中 (600rpm)，37°C 孵育。

6. 用酶標儀讀取熒光讀數。

7. 再次密封孔板置于震蕩孵育器下 37°C。

8. 在1 到 72 小時常規區間讀數。

注意事項

全波長熒光型酶標儀設置參數:

溫度: 37°C
讀取形式: 孔板掃描
波長: 激發光 450 nm，發射光 485nm
PMT 增益: 自動
閃光每讀: 6
震蕩: 讀數前 20 秒