α 突觸核蛋白活體注射建模實驗操作步驟
材料與儀器
材料：雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠、α 突觸核蛋白 PFF 和單體、生理鹽水、手術刀、注射器、DAB 免疫組化需要的材料（1X TBS (含有和不含有 TX-100 的)、30% H2O2、檸檬酸緩沖液、 驢血清 (保存在 -20℃; 凍融穩定的)、 一抗: pSer129-α突觸核蛋白抗體 、 二抗: 生物素-SP 驢抗兔 IgG (H+L)、ABC 試劑、DAB 試劑、孔板 (規格取決于要染色的區域數量)、 漆刷、 玻璃鉤、 漂白劑、 ddH2O、注射器、10 mL 過濾器 0.22 uM 孔徑 、100% EtOH 環保脫蠟劑 (用于清理組織)、顯微鏡載玻片和蓋玻片、封片劑)
儀器：水浴超聲波儀、立體定位儀，通風櫥、顯微鏡
步驟
大鼠蛋白注射步驟
2 uL PFFs 或者單體 (陰性對照) 通過以下兩個腦頂葉區的位置注射（每個注射位點 2uL）:
AP + 1.6, ML + 2.4, DV - 4.2 從頭骨
AP - 1.4, ML + 0.2, DV - 2.8 從頭骨
30 天后, 用生理鹽水灌注大鼠，然后將大鼠腦由冠狀平面切開，將中腦與前腦分開。之后兩部分都用 4% PFA 固定 48 小時.
DAB 操作步驟
第一天: (猝滅, 抗原修復, 阻斷, 一抗)
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 5 次以除去冷凍保護劑。
-把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中，覆蓋好，置于操作臺 20 分鐘。
用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。
-做抗原修復時, 提前在水浴中預熱檸檬酸緩沖液至少 15~30 分鐘。在檸檬酸緩沖液中培養切片一小時，將溫度設置為 37℃，不要震蕩 。
-用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。
-阻斷時, 將切片置于 5% 常規驢血清和 0.25% Triton-100的 TBS 中阻斷 1 小時，冷室、震蕩。
_______ uL 驢血清, _______ uL 10% TX-100
用 1X TBS (震蕩, 室溫) 沖洗切片 3 次。
用含 5% 驢血清的 TBS 制備一抗溶液，稀釋度為 1：5000。用錫紙包好切片，和抗體一起在冷室中震蕩培養過夜。
用 _______ mL TBS,
_______ uL 驢血清, _______ uL pSer129-α 突觸核蛋白抗體
第二天: (二抗, ABC 擴大信號, DAB 染色)
-用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片 3 次. 余下的步驟中，需要一直將切片保留在錫紙里，即使是沖洗的步驟。
-用含 5% 驢血清的 TBS 制備二抗溶液，稀釋度為 1：500。在冷室中培錫紙養蓋好的切片 2 小時，震蕩。
用 ______mL TBS,
______ uL 驢血清, _______ uL 生物素標記的驢抗兔 IgG
-用 1X TBST (震蕩，室溫) 沖洗切片3次。
-用 ABC 試劑培養切片 30 分鐘 (震蕩, 冷室) 。
-用 1X TBS 沖洗切片 3 次 (震蕩，室溫) 。
-用離心管和 ddH2O制備 DAB 溶液，每 5 mL H2O 加入如下溶液然后渦旋混合:
2 滴緩沖溶液
4 滴 DAB 溶液
2 滴雙氧水溶液
注意: 所有接觸過 DAB 的器具只能用來操作 DAB。我們還在通風櫥內準備了一個 DAB 專用的廢液缸。使用玻璃鉤來處理DAB 溶液中的切片而不能用漆刷，并且操作后要用漂白劑沖洗玻璃鉤。盛裝過 DAB 的器皿都需要用漂白劑沖洗并且處理到生物性危害箱中。
-用注射器過濾到新的 6 孔板中。每一個需要染色的腦切片都用一個新的 DAB 孔。
-在DAB中培養每個切片直到變為淺棕色 (2-3 分鐘就足夠; 時間太長可能會造成背景染色太多)
-用 ddH2O 沖洗 3 次
-在 1X TBS 中封片，然后在切片柜中干燥過夜。
第三天: (脫水和蓋玻片)
1. 30 秒 ddH20
2. 3 分鐘 70% EtOH
3. 3 分鐘 95% EtOH
4. 3 分鐘 95% EtOH
5. 3 分鐘 100% EtOH
6. 3 分鐘 100% EtOH
8. 5 分鐘環保脫蠟劑
9. 5 分鐘環保脫蠟劑
-將切片從切片籃從取出，一次一片，置于吸水紙上。
-加封片劑時，取一個 P1000 移液器和吸頭，將吸頭尖剪掉，容量設到 400 到 500 μL.
-連續滴幾滴封片劑 到切片的中間，傾斜切片使封片劑完全覆蓋切片。
-用棉棒的木頭一端趕出切片中的氣泡。
-將切片放在吸水紙上，置于操作臺上過夜晾干。
注意事項
該實驗操作指南是將 1 型小鼠 PFF (SPR-324) 或 1 型人 PFF (SPR-322) 注射到大鼠腦中來產生 alpha 突觸核蛋白病理特征。小鼠 PFF 顯示出了更強的聚集效果。
