α 突觸核蛋白沉降試驗操作步驟

材料與儀器

材料：微量離心管（螺帽管）、Laemmli 緩沖液、PBS、SDS-PAGE 所需材料

儀器：離心機，SDS-PAGE 所需儀器

步驟

1. 將 40μL 的 PFF 移入微量離心管中（最好是螺帽管）。

2. 最大速度離心 60 分鐘。

3. 小心將上清液 (40μL) 轉移到新管中。添加 10μL 的 5X Laemmli 緩沖液并標記為「上清液」。

4. 將沉淀懸浮于 40μL PBS 中，再次最大速度離心 30 分鐘。保存上清液并標記為 「洗滌」 。

5. 將沉淀物懸浮在 40μL PBS 中并標記為 「沉淀物」 ，向該部分添加 10μL 5X Laemmli 緩沖液。

6. 90°C 孵育 10 分鐘。

7. 分別加樣 10μL 「上清液」，「洗滌」和「沉淀物」于 15 孔梳 SDS-PAGE 凝膠，然后進行 SDS-PAGE?？捡R斯亮藍染色和脫色。我們希望大部分的 alpha 突觸核蛋白 (>75%) 存在于「沉淀物」中。

注意事項

原始操作步驟建議使用 40μL，但我們發現 20μL 也可以，并能節省樣品。此外，我們有時會在第二次離心時運行 60 分鐘，而不是建議的 30 分鐘，以確保獲得更好的沉淀物。該沉降試驗應在在原纖化結束時進行，之后再稀釋和分裝。