α 突觸核蛋白沉降試驗操作步驟
材料與儀器
材料:微量離心管(螺帽管)、Laemmli 緩沖液、PBS、SDS-PAGE 所需材料
儀器:離心機,SDS-PAGE 所需儀器
步驟
1. 將 40μL 的 PFF 移入微量離心管中(最好是螺帽管)。
2. 最大速度離心 60 分鐘。
3. 小心將上清液 (40μL) 轉移到新管中。添加 10μL 的 5X Laemmli 緩沖液并標記為「上清液」。
4. 將沉淀懸浮于 40μL PBS 中,再次最大速度離心 30 分鐘。保存上清液并標記為 「洗滌」 。
5. 將沉淀物懸浮在 40μL PBS 中并標記為 「沉淀物」 ,向該部分添加 10μL 5X Laemmli 緩沖液。
6. 90°C 孵育 10 分鐘。
7. 分別加樣 10μL 「上清液」,「洗滌」和「沉淀物」于 15 孔梳 SDS-PAGE 凝膠,然后進行 SDS-PAGE??捡R斯亮藍染色和脫色。我們希望大部分的 alpha 突觸核蛋白 (>75%) 存在于「沉淀物」中。
注意事項
原始操作步驟建議使用 40μL,但我們發現 20μL 也可以,并能節省樣品。此外,我們有時會在第二次離心時運行 60 分鐘,而不是建議的 30 分鐘,以確保獲得更好的沉淀物。該沉降試驗應在在原纖化結束時進行,之后再稀釋和分裝。