微量環境樣本/微生物核酸提取

簡介

環境樣本中的核酸，主要來源包括微生物以及生物脫落的組織、分泌物、排泄物、血液或尸體等，分布在各種水體、土壤、沉積物或空氣等環境中，是微生物和脫落核酸的混合物，這兩類核酸在上述環境樣本中存在較少。不同來源的水體和土壤是環境相關研究課題的主要樣本類型。

原理

經過前處理的水體或土壤樣本通過機械珠磨研磨方案搭配強力化學裂解液進行破碎和勻漿處理，快速有效地使難裂解微生物樣本最大限度充分釋放核酸，然后通過 QIAGEN 獨有的抑制因子去除技術（IRT, Inhibitor Removal Technology）方便快捷地徹底去除殘留的抑制因子，確保下游定量 PCR 和 NGS 檢測的準確性，隨后將液體加載到硅膠膜柱上是核酸進行核酸的特異性結合，洗滌掉雜質后即可洗脫得到核酸。

材料與儀器

AllPrep PowerViral DNA/RNA Kit (QIAGEN)

微型離心機（13000 g)

移液器（50 μl～200 μl ，100 μl-1000 μl)

Vortex-渦旋儀

渦旋儀適配器（1.5-2 ml 管，貨號：13000-V1-24)

β-巰基乙醇（純化 RNA)

100% 乙醇

步驟

1、向 PowerBead Tube 中加入 200 μl 液體樣本。

注：如果希望進行酚裂解，可以在 PowerBead Tube 中加入 100 μl 酚：氯仿：異戊醇 (pH 6.5–8)。

2、向 PowerBead Tube 中加入 600 μl Solution PM1/ β-巰基乙醇混合液。

3、把 Bead Tubes 水平固定在 MO BIO 的渦旋儀適配器（貨號：13000-V1-24）上。 Tube 管帽應朝向渦旋適配器 中心。

4、最大轉速連續渦旋振蕩 10 min。

5、室溫 13000 g 離心 1 min。轉移上清到一個干凈的 2 ml Collection Tube（試劑盒提供）  中。預期上清液約 600 μl。 若使用了苯酚：氯仿：異丙醇， 轉移上面水相層到干凈的 2 ml Collection Tube  （試劑盒提供）  中。

6、加入 150 μl Solution IRS，簡單渦旋混勻，4℃ 孵育 5 min。

7、13000 g 離心 1 min。避開沉淀，把上清轉移到一個干凈的 2 ml Collection Tube（試劑盒提供）  中。此步不能取多于 700 μl 的上清。

8、加入 600 μl Solution PM3 和 600 μl Solution PM4 。簡單渦旋混勻。

注：要回收小片段 RNA，如 microRNA 和 siRNA，把裂解物轉移到能容納至少 2.5 ml 的 Tube 管中，另 外加入 600 μl 100% 乙醇。此步所需的 100% 乙醇自備。

9、轉移 625 μl 上清到 MB Spin Column，13000 g 離心 1 min。去除穿出液，重復操作轉移上述剩下的上清到 MB Spin Column。

注：每個樣品共需反復轉移 3 次上清， 若為回收 microRNA 和 siRNA 而是用了額外的 100% 乙醇，則共需 4 次轉移。

10、Solution PM5 使用前先搖勻。加入 600 μl Solution PM5 到 MB Spin Column，13000 g 離心 1 min。

11、去掉穿出液。加入 600 μl Solution PM4 到 MB Spin Column，13000 g 離心 1 min。

12、去掉穿出液，13000 g 離心 2 min。

13、把 MB Spin Column 放到一個干凈的 2 ml Collection Tube  （試劑盒提供）  中。

14、加入 100 μl RNase-Free Water 到 MB Spin Column 白色柱膜中心，并潤濕整個膜。靜置至少 1 min。

注：使用 100 μl RNase-Free Water 能獲得 DNA/RNA 的最大洗脫效率。要濃度更高的 DNA/RNA，RNase-Free Water 最少可只用 50 μl 。RNase-Free Water 用量不能少于 50 μl。

15、13000 g 離心 1 min。丟棄 MB Spin Column。DNA/RNA 即可用于下游實驗，樣本保存在-80℃。

注意事項

操作前注意事項：

預熱 Solution PM1, 55℃ 加熱 10 min 直至沉淀溶解，使用前震蕩混勻，趁熱使用。提取 RNA 時，向 Solution PM1 中加入 β-巰基乙醇，注意：最好新鮮配制使用，β-巰基乙醇濃度為 10 μl/ml。