微量細胞 DNA 和 mRNA 共提取

簡介

低至單個細胞的 DNA&mRNA 共提取方案，起始樣本支持顯微切割細胞、流式分選細胞、循環腫瘤細胞（CTCs）、胎兒細胞、干細胞、T 細胞等。

原理

細胞裂解后釋放出基因組 DNA 和 mRNA，利用 Oligo-dT 磁珠將 mRNA 與裂解后液體中的基因組 DNA 分離開來，分別進行基因組 DNA 與 mRNA 的純化。對富集有 mRNA 的磁珠進行雜質洗滌后即可洗脫得到 mRNA。與此同時，可利用另一款 APN 磁珠對基因組 DNA 進行富集，同樣洗滌掉雜質后可洗脫獲得基因組 DNA。兩步磁珠法技術可幫助最大限度捕獲更長片段的基因組 DNA 和 mRNA，用于長片段擴增、多重 PCR、數字 PCR、三代測序等應用。

材料與儀器

AllPrep DNA/mRNA Nano Kit (QIAGEN)

離心機

加熱模塊或水浴鍋

0.2 ml、1.5 ml 或 2 ml 離心管、無菌吸頭

一次性手套

乙醇（96%–100%）

步驟

從循環腫瘤細胞中提取基因組 DNA 和 mRNA，細胞在 200 μl AdnaTest 裂解/結合緩沖液（提供）中進行裂解。

mRNA 提取：

1. 向含有細胞裂解物的每個離心管中加入 20 μl Oligo（dT）磁珠。

2. 在允許傾斜和旋轉的設備上，在室溫下緩慢旋轉管子（約 5 rpm）10 min

3. 將離心管放入不帶磁極的 AdnaMag-S 中。向下擺動 AdnaMag-S 以釋放蓋子中捕獲的磁珠和液體。

4. 插入磁極，1 min 后，將含有 DNA 的上清液轉移到新的 1.5 ml 離心管（提供）中，并在 4°C 下儲存直至使用。

5. 用 RNA 純化緩沖液 A 洗滌。

6. 用 RNA 純化緩沖液 B 洗滌。

7. 從 AdnaMag-S 上取下磁極。

8. 向每個離心管中加入 100 μl 冰冷的 Tris·Cl 緩沖液，用移液器重懸磁珠。

9. 將磁極插入 AdnaMag-S。

10. 1 min 后，完全除去上清液。

11. 從 AdnaMag-S 上取下磁極。

12. 根據下游應用的不同，請按照以下兩個選項之一進行操作。

以不帶磁珠的 cDNA 合成為例：加入 10–20 μl 冷的 10 mM Tris·Cl. 加熱至 80°C ，2 min，然后立即將試管放在磁極上。將洗脫的 mRNA 快速轉移到新的無 RNase 管中，然后繼續進行下游應用或在 ?80°C 下儲存。

基因組 DNA 提取：

13.  準備洗脫緩沖液 AVE/APN。對于每個樣品，將 22.4 μl 緩沖液 AVE 與 7.6 μl 洗脫緩沖液 APN 混合。

14. 向含有第 4 步細胞裂解物的每個離心中加入 600 μl RNase-Free Water。

15. 加入 40 μl 蛋白酶 K，渦旋 3 次，并在 56°C 下孵育 10 min。

16. 加入 150 μl 結合緩沖液 APN。

17. 向每個樣品中加入 30 μl 磁珠懸浮液 APN。

18. 室溫下緩慢旋轉孵育（約 5 rpm）10 min。

19. 將試管放入不帶磁極的 AdnaMag-S 中。向下擺動 AdnaMag-S 以釋放蓋子中捕獲的磁珠和液體。

20.  插入磁極，30 s 后，除去上清液。

21. 用緩沖液 APN1 洗滌。

22. 用緩沖液 APN2 洗滌。

23. 從 AdnaMag-S 上取下磁極，取下反應管，并短暫離心。

24. 將反應管放回 AdnaMag-S 架子中，并將磁極插入 AdnaMag-S。

25. 30 s 后，完全去除殘留的洗滌緩沖液。

26. 通過重復移液（5x）將磁珠重懸于 25 μl 洗脫緩沖液 AVE/APN 中，并在室溫下孵育 1 min。

27.  短暫離心。

28.  將反應管放入 AdnaMag-S 中，并將洗脫液轉移到新的 1.5 ml 管中。

29.  將裝有 gDNA 的反應管放在冰上進行后續分析，或儲存在 -30 至 -15°C 下。