細胞培養-細胞計數詳細步驟及方法

細胞計數操作。當儀器的細胞計數分類出現異常時，手動顯微鏡檢查尤為重要。

1，首先準備好細胞計數器（血球計數板）使用70%乙醇將蓋玻片和細胞計數板清潔、晾干備用。將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數器上。（注：使用前須保證蓋玻片和計數板已充分晾干，否則將影響后續細胞充池及計數結果。）

2，制備細胞懸液對于貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養皿表面脫落。（懸浮細胞則無需消化，稀釋到合適倍數即可。）然后加入適當的含血清培養基，中和胰酶的作用并重懸細胞，以得到均質的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹散，不要殘留任何細胞團，但不可用力過大。（注：消化太過或消化不全均會使計數結果產生偏差。）臺盼蘭染色（可選）：如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合；室溫孵育3-5分鐘（懸浮細胞染色時間可視情況適當延長），使臺盼蘭完全進入死細胞，使死細胞著藍色。

3，血細胞計數器加樣使用吸管或移液器將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到計數池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池，此即為充池。（注：若需進行多個樣品的計數，應盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。）以同樣的方式在另一側的計數池中也加入計數樣品。將計數板靜置幾分鐘使細胞擴散、沉降。

4，細胞計數在100倍顯微鏡下，移動計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網格。中央方塊區差不多剛好可以填滿整個視野（下圖標記的3號位置）。分別計數大方格1.2.4.5中的細胞數。（為降低計數誤差，最好將細胞濃度調整為20-50個/大方格。）并重復記錄另一側計數池中的細胞數，總計8個大方塊，然后取均值。計數原則為：“數上不數下，數左不數右”。（判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線，如下圖所示）如果有多個細胞沒有吹散而成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數細胞為單個細胞。

5，細胞濃度每個大方格的容積為：1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數時需乘以104。在常規沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數：每毫升樣品中細胞的個數 = 每個大方格內細胞的平均數 × 細胞稀釋倍數×104如果使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細胞的百分率：活細胞百分率（%）= 臺盼蘭拒染細胞數/總細胞數×100此時活細胞數的計算公式為：每毫升樣品中活細胞的個數 = 每個大方格中細胞的平均數×活細胞比率×細胞稀釋倍數×2×104注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當于稀釋了一倍。看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們為什么要數細胞啊？細胞計數究竟有什么意義呢？其實，當我們想了解細胞的生長情況時，除了直接觀察細胞形態以外，繪制細胞生長曲線、計算細胞倍增時間應該就是廣泛采用的評價指標了。所以盡管使用血細胞計數板手工計數細胞過程十分繁瑣，對實驗者操作者的要求也比較嚴格，現在也已有很多自動化的細胞計數器/儀，但對于科學研究中遇到的各種細胞而言，手工計數仍然是最簡便易行的方法而被廣大實驗室采用。