細胞遺傳學實驗方法之微核測定

　淋巴細胞微核試驗是細胞遺傳學分析之中常用的方法之一。微核率可以有效地判斷染色體畸變率和輻射損傷率。采用Ficoll-paque密度梯度法分離淋巴細胞。用磷酸鹽緩沖鹽水以1:1稀釋血液，并在Ficoll paque上分層。血液PBS:Ficoll的比例保持在4:3。血液在室溫之下以1800 rpm離心35分鐘。去除淋巴細胞層（ESR棕黃色層）并在PBS之中以1200 rpm洗滌兩次10分鐘，然后用RPMI 1640培養基洗滌。用血細胞計數儀計數細胞密度。

　　一、培養條件

　　淋巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養箱中于 37o 培養。通常，每個培養物由 2 毫升培養基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成。培養基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 單位/ml 青霉素、100 ug/ml 鏈霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。

　　在起始后 44 小時將微核測定細胞松弛素 B 加入到培養物中。細胞松弛素 B 阻止細胞完成胞質分裂，導致多核細胞的形成。細胞培養物中細胞松弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。

　　在培養開始后 72 小時，使用細胞離心機 （Shandon, Sewickley, PA） 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然后將細胞以 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風干。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中，在 N2 下干燥。

　　二、細胞染色與微核測定

　　染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多余的液體，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20。然后將載玻片蓋上蓋玻片并置于 37oC 的加濕室中 1 小時。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘后，再次排出多余的液體，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片并再次孵育 1 H。因為熒光標記的抗體暴露在光線下會褪色，此步驟和所有后續步驟應在黃燈下進行。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩沖液中沖洗兩次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） （2 ug/ml） 復染。

　　細胞微核

　　對于淋巴細胞微核測試，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經歷了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測，每個重復培養物中的 500 個細胞，用于計算微核的數量。通過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否。

　　檢測標準如下：1） 細胞應具有完整的細胞質的圓形或橢圓形外觀

　　2） 細胞核應同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜

　　3） 只有經歷過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在

　　4） 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數

　　5） 微核的染色應與主核相似

　　6） 微核應與主核明顯分開。

　　細胞染色

　　復制指數 （RI），細胞分裂動力學的量度，通過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1、2、3 或更多細胞核的細胞百分比，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測。復制指數RI 計算如下：

　　RI = （1x% 單核細胞） + （2x% 雙核細胞） + （3x% tri） + （4x% 四核細胞）……