培養細胞的形態觀察和計數實驗-指示劑法
原理
體外培養的細胞主要有兩種狀態。一種是能貼附在培養支持物上的細胞，如HeLa 細胞、NIH3T3 等，叫貼壁型細胞，體外培養的細胞大多屬于這種細胞。另一種細胞并不貼附在容器的壁上，而是懸浮在培養液中生長，如HL60 細胞，叫做懸浮型細胞，這類細胞主要是血液原性或癌原性細胞。在細胞生物學的實驗中，往往要進行活細胞的鑒定和細胞的計數、調整細胞的密度，是進行實驗不可缺少的一種基本技能。
材料與儀器
HeLa細胞 NIH3T3 HL60 細胞
臺盼蘭染液 胰蛋白酶 EDTA 混合消化液
倒置顯微鏡 細胞計數板 普通光學顯微鏡 乳頭吸管 蓋片
步驟
一、培養細胞形態觀察
1. 將細胞培養瓶從37 ℃二氧化碳培養箱（或溫箱）中取出，瓶口稍稍向上傾斜以免瓶內液體接觸瓶塞或流出瓶口，注意觀察細胞培養液的顏色和清澈度。然后，將細胞培養瓶平穩地放在倒置顯微鏡載物臺上。
2. 打開倒置鏡光源，用10X 物鏡觀察，通過雙筒目鏡將視野調到合適的亮度，并調節雙目鏡的光瞳間距，使左右兩個視場象合而為一。
3. 調節載物臺高度進行對焦，在看到細胞層之后，用細調節器將物像調清楚，注意觀察細胞的輪廓、形狀和內部結構。在觀察時，經常使用的是十倍的物鏡。
4. 結果
貼壁細胞一般有兩種形態，即上皮細胞型和成纖維細胞型細胞。上皮細胞型細胞呈扁平的不規則多角形，圓形核位于中央，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片，如HeLa 細胞。成纖維細胞型細胞形態與體內成纖維細胞形態相似，胞體呈梭形或不規則三角形，中央有卵圓形核，胞質向外伸出2～3 個長短不同的突起，細胞群常借原生質突連接成網，細胞生長時多呈放射狀或漩渦狀，如NIH3T3。
貼壁細胞在生長狀態良好時，細胞均質而透明，細胞內顆粒少，看不到空泡，細胞邊緣清楚，培養基內看不到懸浮的細胞和碎片，培養液清澈透明，而當細胞內顆粒較多，透明差，空泡多，細胞輪廓增強反差較大時，表明細胞機能狀態不良，生長較差。當培養瓶內培養基混濁時，應想到細菌真菌污染的可能。懸浮細胞邊緣，透明發亮時，生長較好；反之，則較差或已死亡。由于培養基內有PH 指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細胞的生長狀態。呈橙黃色時，細胞一般生長狀態較好；呈淡黃色時，則可能是培養時間過長，營養不足，死亡細胞過多；如呈紫紅色，則可能是細胞生長狀態不好，或已死亡。實際上一種細胞在培養中的形態并不是永恒不變的，它隨營養、PH、生長周期而改變，但在比較穩定的條件下形態是基本一致的。在貼壁細胞的培養中，鏡下折光率高，圓而發亮的一般被認為是分裂期細胞。腫瘤細胞有重疊生長的特征。
二、培養細胞的計數及活細胞的鑒定
1. 準備計數板
用95％酒精棉球擦干凈計數板，把蓋片覆在計數板上面。
2. 制備細胞懸液
將培養瓶中的培養液倒入干凈試管中，向培養瓶中加入0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA 混合消化液1 ml，靜置3~5 分鐘，待見到細胞變圓，彼此不連接為止。將試管中的培養液倒回培養瓶中，并輕輕進行吹打，制成細胞懸液。
3. 染色
取細胞懸液0.5 ml，加入0.3％臺盼蘭染液0.5 ml，混合后染色3~5 分鐘。
4. 滴加懸液
將懸液搖勻后，沿蓋片邊緣緩緩滴加少許已染色的細胞懸液于細胞計數板的斜面上，使液體自然充滿整個計數室。小室內有氣泡或液體過多使蓋片漂移時，要重新滴加。
5. 計數
在普通光學顯微鏡10X 物鏡下計數四個大格內的細胞數，壓線者數上不數下，數左不數右。
6. 結果
按下式進行細胞濃度的計算：
大格中細胞總數×104①×稀釋倍數＝細胞數/ml 懸液
大格中細胞總數－染色細胞數×104②稀釋倍數＝活細胞數/ml 懸液
注①由于四大格中每一大格體積為0.1 mm3，1 ml＝10，000 大格，因此，1大格細胞數×104＝細胞數/ml。
注②染色標本在15 分鐘內計數，因為臺盼蘭染液可使死細胞迅速染色，拖延計數時間活細胞也被著色。
進行細胞計數時應力求準確，因此，在科研中，往往將計數板兩側都加上細胞懸液，并同時滴加幾塊計數板（或反復滴加一塊計數板數次），最后取計數的平均值。
