目的基因在真核系統中的表達及細胞內的定位實驗-磷酸鈣法瞬時轉染法
原理
將氯化鈣,DNA和磷酸緩沖液混合,形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒(沉淀)。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。
材料與儀器
真核細胞
HBS CaCl2 TE 質粒DNA
CO2培養箱
步驟
1. 轉染的前一天在35 mm培養皿中植入細胞(約1×106個細胞),使得第二天轉染時細胞匯合率達到50-80%;
2. 轉染前1-4小時,換成不含血清和雙抗的培養基;
3. 在1. 5 ml無菌的離心管中混合下列藥品:
15. 5 μl 2 MCaCl2,最多10 μg質粒DNA,補加TE(pH8. 0)至125 μl;
4. 在無菌的35 mm平皿中加入125 μl 2×HBS(pH7.10),然后逐滴加入上述混合物,一邊加一邊充分混合,使磷酸鈣沉淀均勻,室溫放置20分鐘,這時溶液將有非常小的磷酸鈣沉淀顆粒形成;
5. 20分鐘后,將混合物加入細胞中,37 ℃培養箱中培養4-8小時;
6. 4-8小時后,用含血清的完全培養基替換舊培養基,37 ℃培養箱中繼續培養;
7. 在轉染后24-72小時將細胞置于熒光顯微鏡下觀察目的蛋白的表達。
注意事項
1. 所有操作都必須在無菌條件下進行;
2. 2× HBS 、2 M CaCl2和TE須經0.22 μm濾器濾菌分裝后使用;
3. 沉淀的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準,保證質量,因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。