小鼠輸卵管卵母細(xì)胞采集與結(jié)構(gòu)觀察實驗-顯微鏡觀察法
原理
哺乳動物的卵子發(fā)生在卵巢的卵泡內(nèi)進(jìn)行。在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育階段，初級卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)現(xiàn)象，并完成第一次成熟分裂(減數(shù)分裂，以同源染色體分離為特征)，并排出第一極體。一般認(rèn)為，GVBD的發(fā)生和第一極體的排出是卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志。之后，次級卵母細(xì)胞進(jìn)行第二次成熟分裂(一般為有絲分裂,以染色單體分離為特征)，并停滯在第二次成熟分裂中期。在這期間，完成胞質(zhì)的最后成熟。這時，卵泡發(fā)育成熟，將處于第二次成熟分裂中期的卵母細(xì)胞連同周圍的卵丘細(xì)胞隨著卵泡液排出。排出的卵母細(xì)胞經(jīng)過輸卵管漏斗部進(jìn)入輸卵管，運(yùn)行到受精部位輸卵管膨大部（壺腹部）。卵母細(xì)胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接著形成一個已受精的合子并放出一個小的第二極體。
材料與儀器
小鼠
生理鹽水 胚胎回收操作液
顯微鏡 擦鏡紙 恒溫水浴鍋 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 器械盤 手術(shù)剪 手術(shù)鑷子 眼科剪 眼科鑷子 眼科異物針 表面皿 卵母細(xì)胞吸管 檢卵杯 酒精棉球 吸管 注射器 針頭 針頭盒 酒精燈 注射器 針頭 孕馬血清促性腺素 人絨毛膜促性腺素 酒精棉球 鑷子 電子天平 藥勺 青霉素瓶 膠布 記號筆
步驟
一、激素的分裝、配制
激素廠家生產(chǎn)的超排用生殖激素，如孕馬血清促性腺激素、人絨毛膜促性腺激素等。用于小鼠超排時，其包裝劑量較大，一般不會一次用完。而由于這些激素的化學(xué)特性，一旦經(jīng)過稀釋，在溶液中的生物學(xué)活性會很快下降并失活，大劑量稀釋后即使不用也不能保存多久。所以，在使用前應(yīng)將市售包裝進(jìn)行分裝。分裝時，需要自行稱量一個包裝的激素凈重，按照凈重與該包裝標(biāo)示的激素單位，換算出每單位重量的激素單位數(shù)。然后根據(jù)每次超排需要使用激素的單位數(shù)，用精密電子天平對激素進(jìn)行稱重、分裝，裝入滅菌的干燥青霉素瓶中，用膠布密封每個小包裝，并用記號筆標(biāo)記日期、重量及激素單位數(shù)，放入4 ℃冰箱待用。臨用前，取出一個小包裝，按照每只小鼠腹腔注射0.2 mL(或0.5 mL)的溶液量，用溶劑(一般用滅菌生理鹽水)進(jìn)行稀釋。
二、小鼠超排處理日程安排與超排處理
于實驗開始的當(dāng)天（0天）下午3:00～5:00，選擇陰門淡粉紅色的雌性青年小鼠，這時小鼠正處于臨近發(fā)情開始前，進(jìn)行超排處理效果較好。抓住小鼠后，腹腔注射PMSG 8～10單位。于注射PMSG后的48～50小時，再給每只超排鼠腹腔注射hCG 8～10單位，注射hCG 15~17小時，從輸卵管壺腹部回收卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體。
三、小鼠卵母細(xì)胞采集及結(jié)構(gòu)觀察
頸椎脫臼法處死實驗小鼠，用70％的酒精棉球消毒腹部。在下腹部中間剪開一個小口(圖4-2A)，兩只手或用鑷子分別抓起切口的上下部皮膚向頭部和尾部牽拉，直到充分暴露腹部(圖4-2B)。切開腹膜，將內(nèi)臟向上翻，即暴露兩側(cè)卵巢和輸卵管(圖4-2C)。用眼科鑷子夾住子宮與輸卵管聯(lián)結(jié)處，用鋒利的剪刀剪開輸卵管系膜(圖4-3A)，之后先剪斷卵巢和輸卵管之間的聯(lián)系結(jié)構(gòu)(圖4-3B)，再剪斷子宮與輸卵管聯(lián)結(jié)處，即得到輸卵管部分，將輸卵管轉(zhuǎn)移到盛有PBS的表面皿中。
用眼科剪盡量除去輸卵管上的脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球混入液體妨礙檢卵。由于小鼠輸卵管非常細(xì)，不容易直接沖洗管腔。將表面皿置于實體顯微鏡載物臺上，在20或40倍鏡下找到輸卵管膨大部（壺腹部）(圖4-4)，用一支眼科異物針固定輸卵管，用另一支異物針?biāo)洪_壺腹部，一般情況下，卵丘-卵母細(xì)胞團(tuán)會自動移出。初學(xué)者對輸卵管膨大部判斷不準(zhǔn)時，可用異物針縱向撕開整個輸卵管。此時，卵母細(xì)胞周圍包裹卵丘細(xì)胞，多個卵聚集成積云狀。將卵母細(xì)胞團(tuán)移到含透明質(zhì)酸酶的液體中，卵母細(xì)胞就會分散成單個細(xì)胞。用較細(xì)的吸管檢出卵母細(xì)胞到檢卵杯中，用PBS洗3次，在實體顯微鏡下觀察卵母細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
卵母細(xì)胞通常為圓球形。小鼠卵母細(xì)胞較小，直徑為70~90um左右，由透明帶包圍卵胞質(zhì)構(gòu)成。透明帶外有放射冠，是由具有胞質(zhì)突起的呈放射狀排列的細(xì)胞(卵丘細(xì)胞)構(gòu)成的。MII期卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志是第一極體排出，小鼠卵母細(xì)胞的第一極體較大，容易辨認(rèn)。
常見問題
卵母細(xì)胞通常為圓球形。小鼠卵母細(xì)胞較小，直徑為70~90um左右，由透明帶包圍卵胞質(zhì)構(gòu)成。透明帶外有放射冠，是由具有胞質(zhì)突起的呈放射狀排列的細(xì)胞(卵丘細(xì)胞)構(gòu)成的。MII期卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志是第一極體排出，小鼠卵母細(xì)胞的第一極體較大，容易辨認(rèn)。
