磷酸鈣法轉染 HEK293T 細胞
原理
常規轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染（永久轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統。
材料與儀器
293T細胞
無菌水ddw NaCl KCl Na2HPO4 glucose HEPES CaCl2
Eppendorf管 培養皿 培養箱
步驟
1. 鋪細胞： 選擇狀態良好的293T細胞傳代， 2-3x105個細胞/35mm dish。
2. 20-24h后，待細胞長至鋪滿瓶底約50-70%的時候，進行轉染。下面就35mm dish為例，采用以下轉染體系：
ddw： 105ul
plasmid： 2ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）
2M CaCl2： 16.5ul
2XHBS： 125ul
按上述順序，往eppendorf管中依次加入上述四種試劑。
先將前三者混勻， 最后加2XHBS。
一種方法是，加2XHBS時要逐滴加入， 吹打至微現乳白色， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。
另一種方法是， 加入2XHBS后立即吹打約40下（不過這個要根據每個人的力道和吹打的頻率而定， 建議做一個梯度實驗，吹打不同的次數看哪次的轉染效率高以后就按這個次數來吹打）， 之后步驟同上， 立即均勻滴入培養皿，輕輕搖勻后置于培養箱中，6-8h后換液。
注意事項
1.HBSP 緩沖液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 時轉染HEK 293T 細胞的效果不好 ,細胞成活率低， 有大顆粒狀物體存在;pH 值在 6 .96 時轉染效果好，細胞存活率高， 藍染細胞明顯。
2.未純化的 lacZ-pShuttle 質粒轉染 HEK 293T 細胞轉染效率低， 細胞成活率很低，而純化后的質粒轉染效率高 ,藍染細胞明顯 。
常見問題
1.轉染后培養 6h 進行甘油休克效果最佳，比培養 0h 直接進行休克轉染效率升高584.4 %。
2.甘油休克時間為4.5min 時轉染效果最佳，比不用甘油休克轉染效率升高 130.8 %。
3.來源于論文《一種用磷酸鈣法高效轉染 HEK 293T 細胞方法的建立》,陳曉,蔣捍東,路新枝,于文功。
